不同红三叶品种生产性能及异黄酮含量的比较

宋 超，靳晓丽，田新会，杜文华

（甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州730070）

红三叶（Trifolium pratense）又名红车轴草、红花苜蓿、金菜花、红荷兰翘摇等，为豆科三叶草属牧草，是世界上栽培最早和最重要的牧草之一。在英国和新西兰，它是继白三叶（Trifolium repens）之后的第2大豆科牧草，在美国，种植面积仅次于紫花苜蓿（Medicago sativa）［1－3］。目前，已成为欧洲，加拿大及澳大利亚等地区重要栽培豆科牧草之一。我国江淮流域、华南、西南等地均有栽培，是我国长江流域以南及甘肃省高寒阴湿区优良的豆科牧草［4－9］。红三叶异黄酮具有抗癌，调节激素平衡，改善骨质疏松，妇女更年期综合症等作用［10－12］，是一种极具开发前景的药用植物。杜文华等［13，14］研究表明，目前国内审定登记的5个红三叶品种均属中低异黄酮品种，且重度感染白粉病。因此，如何提高甘肃省主栽红三叶品种岷山红三叶的异黄酮含量以及抗性成为当前红三叶生产亟待解决的问题。国外种质资源由于地域差异，有时会表现出优异的特性［15］。笔者将收集到的5份澳大利亚红三叶品种，在兰州地区试种，以期从中选择高产抗病品种，为红三叶育种提供优异种质资源。

1 材料和方法

1.1 供试材料及引种地气候概况

供试5个品种系澳大利亚东南沿海引进（表1），海拔50～200m，属亚热带湿润气候，年降水量2000 mm，主要集中在春秋两季。全年普遍偏暖，年温度变化12～38℃，少见霜期。岷山红三叶为对照。

表1 供试材料及来源Table 1 Varieties and resources for test

1.2 试验地概况

试验在甘肃农业大学校园试验地进行。地理位置N 36°03′，E 103°52′，海拔1 560m ，年均气温8.5℃，降水量380mm，蒸发量1 486.5mm，无霜期171d。土壤栗钙土，有机质含量0.84%，pH 7.28，含盐量为0.25%，有效氮95.05mg/kg，有效磷7.32mg/kg，有效钾182.80mg/kg。

1.3 试验设计及管理

2011年3月29日进行播种，播量15kg/hm2，东西向条播，行距30cm，播深1～2cm，出苗后浅水漫灌保苗，之后视土壤水分状况适量灌水。播种前精细整地，施尿素（60kg/hm2）、钾肥（45kg/hm2）各1次。苗期、现蕾期、开花期和结荚期分别灌水，防除杂草，其他同大田管理。

1.4 观测指标及方法

1.4.1 物候期观察 观测出苗期、分枝期、现蕾期、开花期、结荚期、成熟期，二年生牧草返青期。目测50%植株达到该物候期为准。具体物候期的划分标准参照文献［8］。

1.4.2 分枝数、叶面积和株高 第1次刈割时（初花期，小区内有20%植株开花）测定分枝数，按株行取样（1m样段），重复3次，计算平均值；叶面积选取主茎第1枚花序处三出复叶的中部叶片，测定叶长和叶宽，采用A＝KLW（A叶面积；K校正系数；L叶长；W 叶宽）计算叶面积［16］；株高 在各小区内分别选取有代表性株行，测定自然高度，重复5次，计算平均值。

1.4.3 草产量、茎叶比和鲜干比 初花期进行。每个小区随机选取有代表性株行取1m样段，齐地面刈割，称取鲜草重。刈割后，在红三叶到达同一生育期时，再次刈割，计算年产草量。初花期随机抽取10个枝条，分别测定叶片重（刚开放的花序作为叶片）和茎秆重，计算茎叶比。将收获的鲜草分别置于65～70℃干燥箱内烘7～8h，称取干草重。根据鲜草和干草重，计算鲜干比，结果以2次测定的平均值表示。

1.4.4 花序长度、小花数和千粒质量 花序长度和小花数在各品种盛花期随机挑选花序10个，分别测定花序长度和每个花序的小花数；千粒质量 从各品种中随机数取1000粒种子，称重，设3次重复，求其平均值。

1.4.5 营养成分测定 室内分别测定2次刈割后各品种的水分、粗蛋白、粗纤维、粗灰分和粗脂肪含量。粗蛋白含量采用半微量凯氏定氮法；粗纤维含量采用酸碱法；粗灰分含量采用灰化法；粗脂肪含量采用索氏抽提法。结果以两次测定的平均值表示［17］。

1.4.6 异黄酮含量分析 精确称取红三叶样品2g，用脱脂滤纸包好，置于全自动索氏抽提仪中，加入50 mL 70%乙醇浸泡10h后在90～95℃恒温水浴条件下抽提10h，提取液用75%乙醇定容至50mL。取红三叶异黄酮提取液5mL，置于10mL水解管中，加入37%HCl 2mL，在83～85℃恒温水浴锅中水解2.5 h，取出后冷却至室温，用70%乙醇定容至10mL。取2mL水解液经0.45μL微孔膜至2mL离心管中，进行液相色谱分析。

异黄酮高效液相色谱分析 检测器为Agilent1100VWD可变波长检测器；分析柱Eclipse XDB－C8（4.6×150mm）；检测波长260nm（检测波长设定参照文献［18］），流动相为乙腈水梯度洗脱，25min内乙腈由20%增加到70%；1mL/min流速；进样量20μL，首先进混标样1针，之后每4个样品后进一针混标样。

1.4.7 数据分析 采用Excel 2003，SPSS 17.0进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同红三叶品种物候期

6个红三叶品种播种当年，岷山红三叶从出苗到成熟期时间最短，与3、4、5号红三叶相比较提前5～10d，1、2号红三叶的物候期与岷山红三叶相比较长，约20d（表2）。出苗期到开花期最短的是岷山红三叶，为86d，最长的1、2号为97d，可能是由于1～5号品种由热带亚热带引进，兰州地区年均温较低，其生长发育减缓所致。

表2 不同红三叶品种播种当年的物候期Table 2 Phenological phases of red clover varieties in the first year月－日

2.2 不同红三叶品种分枝数，叶面积及株高

不同红三叶品种的分枝数，叶面积和株高均存在差异（图1）。4号的分枝数最多，为42个/m，除与2号和ck无显著差异外，与其他品种间均差异显著（P＜0.05）；4号叶面积最大，为7.15cm2，与除ck外的其他品种均有显著差异；3号株高为65.4cm，显著高于其他品种。

图1 红三叶品种当年分枝数、株高及叶面积Fig.1 The number of shoot，leaf area and plant height of the different red clover varieties in the first year

2.3 不同红三叶品种小花数、花序长和千粒质量比较

6个红三叶品种的花序长度无显著差异，变幅为3.43～3.76cm（图2）。其中，5号小花数最多，为130个/花序，其次为岷山红三叶（120个/花序），1号最少，为103个/花序；4号千粒质量最高，为1.58g，与其他品种间均存在显著差异（P＜0.05），2号最低，为1.47 g。

图2 不同红三叶品种生长当年小花数，花序长及千粒质量Fig.2 The number of floret per inflorescence，and TSW of red clover varieties inthe first year

2.4 不同红三叶品种产草量、鲜干比和茎叶比

第1茬、第2茬产草量最高的均为4号红三叶，其年产草量与其他品种间均存在显著差异（5号除外）；1号第2茬产量占第1茬的85%，说明其再生性能良好，ck次之，2号再生性能较差；4号红三叶鲜干比最小，显著低于其他品种，鲜干比最高的为3号，与其他品种均存在显著差异（P＜0.05），说明4号红三叶积累干物质的能力较强（表3）。茎叶比最高的为2号红三叶，显著高于其余品种，说明其叶量较大，具有较好的适口性。

表3 不同红三叶品种的产草量、鲜干比和茎叶比Table 3 Hay yield，leaf stem ratio and fresh dry ratio of 6 red clover varieties in the first year

2.5 不同红三叶品种营养成分比较

在6个红三叶品种中，1号粗蛋白含量最高，4号次之，5号最低；2号粗纤维含量最低（21.07%），5号粗纤维含量最高（26.86%），其他品种粗纤维含量均在21%～23%。粗脂肪含量最高的为4号（2.51%），5号最低（2.11%）；5号粗纤维含量显著高于其他品种。6个红三叶品种中钙、磷含量变动不大，分别在1.12%～1.35%和0.28%～0.32%（表4）。试验发现粗蛋白含量较高的红三叶品种，其粗纤维含量一般较低，且鲜干比和茎叶比较高，这可能是由于叶片中纤维素含量低，而叶量较多，积累糖类的能力较强，可转化为较多的蛋白类物质所致。

表4 不同红三叶品种营养成分Table 4 Comparison on the nutrition value among red clover varieties in the first year%

2.6 不同红三叶品种异黄酮含量比较

根据混标溶液与样品水解液的HPLC图谱做出拟合度曲线（图3），样品与混标液的拟合度较准确。图3中各异黄酮单体的出峰位置按时间先后顺序分别为大豆黄素、染料木素、刺芒柄花素、鹰嘴豆芽素A，参照此出峰顺序以及出峰时间，分别记录品种各异黄酮单体的出峰位置，通过Agilent 1100检测器软件计算出样品种各异黄酮单体的峰面积。

图3 红三叶异黄酮提取液与混标液拟合度曲线Fig.3 Isoflavone extract of red clover and mixed standard solution fitting curve

2.6.1 4种异黄酮单体标准曲线 4种异黄酮单体的标准曲线（表5），大豆黄素、染料木素、刺芒柄花素、鹰嘴豆芽素 A 的相关系数R2分别为0.996、0.994、0.990、0.995，4种异黄酮的标准曲线线性关系均表现较好。

2.6.2 不同红三叶品种异黄酮含量分析 3号红三叶的异黄酮总量最高，其次为1号，岷山红三叶的最低（表6）。不同品种中4种异黄酮单体变化显著。其中，3号红三叶大豆黄素含量显著高于其他品种，达到533.03μg/g，分别是2号及岷山红三叶的4.9倍和4.06倍；染料木素含量最高的为1号，达到1 339.86 μg/g，其次为5号（1 324.18μg/g），为其余品种的2～3倍；刺芒柄花素含量最高的为3号红三叶，达到4 936.45μg/g，显著高于其他品种，是含量最低的岷山红三叶的1.83倍。5号红三叶鹰嘴豆芽素A含量最高，为1 827.21μg/g，是含量最低的岷山红三叶的2.10倍。

表5 异黄酮单体标准曲线Table 5 Standard curve equation of isoflavones monomer

表6 不同红三叶品种异黄酮含量分析Table 6 Analysis of isoflavone monomer content of different red clover varieties μg/g

3 讨论与结论

（1）6个红三叶品种中，岷山红三叶的生育期最短，Astred的生育期最长。可能因为岷山红三叶作为种植多年的当地品种，适应性较强，生长发育进程较快。其他5个红三叶品种均从亚热带湿润气候的澳大利亚昆士兰州引进，对甘肃兰州地区的冷凉干旱气候尚不适应所致。

（2）各参试红三叶品种中，1号粗蛋白含量最高；2号叶茎比高于其他品种；3号红三叶异黄酮总量、鲜干比及株高最高；4号鲜草产量、分枝数、千粒质量优于其他品种；5号小花数，花序长最高。试验中发现粗蛋白含量较高的红三叶品种，其粗纤维含量一般较低，且鲜干比和叶茎比较高。与徐玉鹏等［19］］研究得出牧草中叶茎比高，粗蛋白含量高的品种，粗纤维含量较低的结果相一致。

（3）试验中发现不同红三叶品种中异黄酮单体含量最高的均为刺芒柄花素，其次为鹰嘴豆芽素A，大豆黄素含量最低。与赵娜等［20］的研究结果一致。植物体内次生代谢产物含量的多少取决于植物本身积累这种次生代谢物质的能力［21］，说明红三叶积累刺芒柄花素的能力最强，其次为鹰嘴豆芽素A，大豆黄素的积累能力最弱。不同红三叶品种异黄酮总含量差异显著，3号含量最高，其次为1号，5号，岷山红三叶的含量最低。4种异黄酮单体中，3号的大豆黄素以及刺芒柄花素的含量最高，1号中染料木素含量最高，5号中鹰嘴豆芽素A含量最高，说明基因型对4种异黄酮总含量以及单体含量变化影响显著，与张大勇等［22］的研究结果一致。5种引进红三叶品种异黄酮总量均高于岷山红三叶，且异黄酮单体含量最高值并不集中于某一品种，3号，1号，5号均可作为红三叶异黄酮含量改良的优良种质来源。

目前国内关于植物黄酮类物质的研究主要集中在提取及应用方面，关于异黄酮含量对植物产量及品质影响报道较少，刘晓玲等［23］研究发现，抗病植株的主要异黄酮含量较高，感病植株较低，研究发现异黄酮在人体内具有抗氧化作用［24，25］，具体在植物组织中有无类似作用，有待进一步研究。

（4）试验发现各红三叶品种优良性状不集中，另外红三叶为多年生牧草，其生产性能受株龄，抗病性等影响［12］，以后的试验中，应结合株龄、抗性等指标进行综合评价，以筛选出高产抗病品种。

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