高效降解棉粕中游离棉酚菌种的筛选

刘建成 马贵军 蒋粒薪

棉籽粕（cottonseed meal,CSM）是棉籽经脱壳、加热、压扁成薄片用溶剂浸出油后，所剩余的副产品。棉籽粕中含粗蛋白40%以上，还含有丰富的赖氨酸、蛋氨酸，是畜禽饲料中非常有价值的一种原料。我国是一个产棉大国，每年有1100万吨以上的棉籽，年可产棉籽饼粕600万吨以上，资源量全球第一。棉籽饼粕是一种极具开发潜力的植物蛋白饲料资源，但是棉籽饼粕中含有有毒物质游离棉酚，会对动物的生产、发育和繁殖等方面产生不良影响，从而限制了棉籽饼粕安全而有效地用作动物蛋白饲料，部分地区将其作肥料，造成饲料资源的严重浪费。

棉籽饼粕的主要脱毒方法有物理法 (热处理、机械压榨、有机溶剂浸提)、化学法(硫酸亚铁、氢氧化钙)以及微生物发酵法。最具有应用前景的是微生物发酵法，该法不但能脱除棉籽饼粕中的游离棉酚，而且还可以提高棉籽饼粕的蛋白质含量，并且发酵底物中存留许多酶类、维生素、氨基酸以及一些促生长因子，从而大大改善棉粕的营养价值和饲用价值，提高棉粕利用率。

本研究尝试从对动物有益的酵母菌属、芽孢杆菌属及乳酸菌属中筛选出能高效降解棉粕中游离棉酚的菌株，对棉粕进行固态发酵。降低棉粕中游离棉酚含量，并产生大量益生菌、乳酸、生长因子，提高动物免疫力，改善棉粕的营养价值和饲用价值，提高棉粕利用率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌种：芽孢杆菌属2株：B－1、B－2。乳酸菌属4株：L－1、L－2、L－3、L－4。酵母菌属 4 株：Y－1、Y－2、Y－3、Y－4。以上菌株均购自中国工业微生物菌种保存中心（CICC）。

原料：棉粕购自新疆新光油脂厂。

1.2 培养基

单菌培养基（g/l）：糖蜜 40、蛋白胨 10、葡萄糖 1、磷酸氢二钾 0.5、硫酸镁 0.2，pH值7.0～7.2，121℃高压灭菌25 min。

固体发酵培养基（g/kg）：棉籽粕 950、麸皮 45、天康酶制剂5、糖蜜10、水700。

1.3 试验方法

1.3.1 脱酚细菌菌株的初筛

以棉籽仁（含游离棉酚7012.98 mg/kg）作为培养基唯一营养物，配制棉酚含量为200 mg/kg的初始筛选平板。将6株细菌的单菌培养液稀释后涂于初始筛选平板上，在生化培养箱中30℃培养观察。

1.3.2 脱酚酵母菌菌株的初筛

以固体发酵培养基为基础，配制棉酚含量为200 mg/kg的初始筛选培养基。按2%的接种量，将培养后的不同酵母菌液接种于灭菌后的初始筛选培养基中，充分混匀后于30℃生化培养箱培养，测定发酵后培养基中菌含量。

1.3.3 灭菌条件下的固态发酵

将固体发酵培养基各成分充分混匀后，装入100 g/500 ml在三角瓶中，于121℃高压灭菌25 min。冷却至室温后，按2%的接种量，将培养后的单菌液稀释10倍后接种，混匀后于30℃生化培养箱培养发酵。

1.3.4 不灭菌条件下的固态发酵

按2%的接种量，先将菌种、糖蜜和水充分混匀，再与混匀后的固体发酵培养基混合，充分搅拌后装于500 g取样袋中，密封后放于生化培养箱中30℃恒温发酵。

1.4 测定方法

细菌总数的测定：饲用细菌总数的测定采用GB13093—91方法；

酵母菌总数的测定采用麦芽汁平板进行稀释涂平板计数；

游离棉酚的测定采用苯胺法（GB13086—91）。

2 结果与讨论

2.1 脱酚细菌菌株的初筛结果(见表1)

表1 细菌菌株初始平板筛选试验结果

从表1可知，菌株B-1和B-2在营养物质单一而棉酚含量较高的棉仁汁培养基平板上长势良好。说明其生长和耐酚能力较强，并有可能利用棉酚作为营养物质进行生长代谢，从而起到降解棉酚的作用。而乳酸菌类在此条件下不具有这一特点。

2.2 脱酚酵母菌菌株的初筛结果(见表2)

表2 酵母菌菌株初始筛选试验结果

从表2可知，所选4株酵母菌均能在初始筛选固体培养基上长势良好。其中菌株Y-4长势最好，平均每克培养基中含菌量可达10亿个。

2.3 单个细菌在灭菌条件下生长情况及脱酚率的试验结果(见表3)

由以上结果，我们可以看出乳酸菌类在灭菌后的固体发酵培养基上生长差，可能是因为其对营养要求较高，而棉仁汁培养基中不仅营养物单一，还含有较高的游离棉酚。并且高温灭菌过程可能会对棉粕中的一些营养物质造成了破坏，不利于乳酸菌的生长，从而也导致乳酸菌类对棉酚的脱除效果不好。而芽孢杆菌属的两株菌B-1和B-2在固态发酵培养基上长势良好，说明其对营养要求低，生长能力较强。其中菌株B-2对棉粕中游离棉酚有较强的脱除效果，其脱酚率达到35%。

表3 细菌单菌固态发酵脱酚率的测定结果

2.4 单个酵母菌在灭菌条件下生长情况及脱酚率的试验结果(见表4)

表4 酵母菌单菌固态发酵生长情况及脱酚率的测定结果

从以上4株酵母菌在灭菌条件下脱酚率的试验结果可以看出，4株酵母菌中菌株Y-4的脱酚率最高，为41.4%，其次是菌株Y-3为22.4%，菌株Y-1的脱酚率为15.9%，而菌株Y-2只有5.0%。分析原因可能是因为4株酵母菌中Y-4和Y-3在固体发酵培养基上长势更好，其活菌总数均可达到108cfu/g，从而增强了菌体细胞对棉酚的降解。

2.5 单个细菌在不灭菌条件下生长情况及脱酚率的测定试验结果(见表5)

表5 不灭菌条件下6株细菌生长情况及固态发酵脱酚率的试验结果

6株细菌在不灭菌条件下进行固态发酵，均对培养基中游离棉酚具有一定的脱除作用。其中乳酸菌属的菌株在物料不灭菌条件下生长情况和脱酚率都比灭菌条件下好。可能是因为物料未经高温灭菌，消除了高压灭菌对物料中营养物质的影响，促进了这些菌的生长。另一方面物料中自然菌的繁殖对目标菌的生长和游离棉酚的降解也可能起到了一定的促进作用。而菌株B-2在物料不灭菌条件下脱酚率也比其他菌株好，达到了38.2%。因此确定主要脱酚细菌菌株为：B-2。

2.6 单个酵母菌在不灭菌条件下生长情况及脱酚率的测定试验结果(见表6)

表6 不灭菌条件下4株酵母菌固态发酵脱酚率的试验结果

由以上结果可知菌株Y-4在物料是否灭菌上的脱酚率差异不显著，说明菌株Y-4受外界影响较小，脱酚能力比较稳定，并且菌株Y-4及Y-3的脱酚率始终优于其他两株菌。菌株Y-2及Y-1在未灭菌物料上的脱酚率明显高于灭菌物料上的脱酚率，这可能是因为未灭菌物料中的自然菌的生长对这两株菌的脱酚效果具有一定的促进作用。从活细胞数上可以看出菌株Y-4和Y-3长势略优于其他两株菌，与前期试验结果一致。在游离棉酚的测定结果中，菌株Y-4脱酚能力最强，脱酚率最高为47.5%，Y-3次之为44.6%。因此，确定最佳脱酚酵母菌为Y-4。

3 讨论

3.1 脱酚菌株的筛选

为了能达到通过微生物发酵降解棉粕中游离棉酚的目的并实现工业化大生产，本试验参考了前人研究的成果并结合了本公司现有的生产工艺及产品特点，将菌种筛选范围缩小在芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌三个菌属的十株菌中，具有一定的局限性。在棉粕原料、棉地土壤等其他环境中可能存在更为有效地降解棉粕中游离棉酚的菌种资源，有待于进一步研究。

3.2 高压灭菌的作用

为了消除杂菌的影响，有效的测定所选菌株对棉粕中游离棉酚的降解作用，试验先期采取了对固体发酵培养基高压灭菌处理。试验过程中发现，固体发酵培养基经高压灭菌处理后，其所含游离棉酚含量明显降低。这和施安辉、贾晓锋等得出的结果一致。因高温高压有助于使游离棉酚变成结合棉酚，对微生物脱酚能力的筛选不利，并且在工业化大生产中对大宗原料进行高温高压灭菌处理难度很大、成本高，难以实现。于是又研究了对固体发酵培养基不灭菌处理，综合了灭菌和不灭菌两种方式下不同菌株的脱酚效果，从中筛选出了能高效降解棉粕中游离棉酚的有效菌种B-2和Y-4。

3.3 菌种的组合

试验研究了3个不同微生物属中的10株不同菌在单菌发酵过程中对棉粕中游离棉酚的降解情况。为了弥补单个菌种的不足，目前大多数研究者都倾向于进行复合菌发酵。如张文举等利用热带假丝酵母ZD-3和黑曲霉ZD-8对棉籽饼底物进行复合发酵，可极显著降低棉籽饼底物中游离棉酚含量，脱毒率为91.64%。夏新成等利用复合发酵(两株酵母和一株霉菌)可显著降低棉籽粕底物中游离棉酚含量，最高降解率达86.24%。因此有必要对本试验所筛选出来的菌种进行不同比例的复配，进一步研究在不同菌种组合条件下，复合菌的脱酚效果，以提高脱酚率。

4 结论

从实验室保藏的可用于动物饲料生产的10株菌中筛选出了2株能有效降解棉粕中游离棉酚的菌株Y-4和B-2。通过在灭菌条件下的固态发酵试验，确定了各个菌株的脱酚率，其中菌株Y-4和B-2脱酚率最高分别为41.4%和35%。为了实现工业化大生产，进行了不灭菌条件下的固态发酵试验，结果表明各个菌株均对棉粕中的游离棉酚具有一定的降解作用，其中菌株Y-4和B-2的脱酚率较高，分别为47.5%和38.2%。

该研究结果对微生物发酵降解棉粕中游离棉酚提供了高效菌株，也为进一步探索菌株Y-4、Y-3及B-2发酵脱酚条件奠定了基础，对于微生物发酵降解棉粕中游离棉酚的工业化生产具有一定的指导意义。

18篇，刊略，需者可函索）