电针对子宫内膜异位症大鼠环氧合酶-2的影响

孔伟光,张春雁,张树辉,蒋文燕,邴兴红,李连波,陈云飞



电针对子宫内膜异位症大鼠环氧合酶-2的影响

孔伟光1,张春雁2,张树辉2,蒋文燕2,邴兴红2,李连波2,陈云飞2

(1.内蒙古中蒙医院，内蒙古呼和浩特 010020；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,上海 200437)

探讨电针对子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)大鼠环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的影响及其预防大鼠EMs的效应机制。建立大鼠EMs模型,随机分为模型组、电针组、COX-2抑制剂组、P450arom抑制剂组、去卵巢组,并设立假手术组。电针组电针血海、三阴交穴;COX-2抑制剂组采用塞莱西布胶囊生理盐水混悬液灌胃;P450arom抑制剂组采用阿纳曲唑片生理盐水混悬液灌胃;卵巢去势组切除双侧卵巢;假手术组和模型组捆绑固定并行生理盐水灌胃。治疗及对照处理2星期和4星期后处死各组大鼠,测量各组大鼠异位囊肿长、宽、高三径并计算平均值,取异位组织进行组织病理学观察,并测定血清及组织中COX-2的蛋白水平与组织中COX-2 mRNA的表达水平。异位囊肿三径平均值的比较,模型组均明显大于其他各组(均＜0.05),电针组明显小于模型组(＜0.05),且比较4星期与2星期电针组可见其生长较缓慢,异位内膜趋于萎缩,部分上皮细胞坏死;电针组血清中COX-2水平、异位内膜组织中COX-2水平及异位内膜组织中COX-2 mRNA表达水平均明显低于模型组(＜0.05),并随着疗程的延长效果更明显。电针可能通过调节异常升高的COX-2 mRNA水平,进而影响COX-2蛋白的合成,下调外周血和局部组织中COX-2的表达而预防大鼠EMs的发生与进展。

针刺疗法;电针;子宫内膜异位症;环氧合酶-2;大鼠

子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是育龄妇女的常见病,多发生在30～45岁的女性,是一种与不孕密切相关的妇科多发病,其发病率呈逐年上升趋势,Wu等[1]报道内异症的发病率达15%～20%,在不孕症患者当中的发病率高达50%。痛经、不孕作为其主要临床表现,严重影响患者生活质量。现已基本形成了内异症的临床诊治指南,主要是针对疼痛、包块和不孕的手术(主要是腹腔镜)、药物及助孕技术等治疗对策[2]。但本病难以根治,术后3年复发率为38%～51%[3],且上述疗法均存在缺陷[4],倘若能够在本病发生的早期予以预防干预,降低内异症的发病率,其临床意义将会更大。因此,研究本病的发病机理,探索早期干预的治疗手段,防患于未然,是当前妇科学亟待解决的问题之一。中医学中针灸疗法在本病的治疗上取得了一定的成效,电针是目前临床上治疗本病的主要手段之一,本研究即采用电针疗法作用于EMs大鼠模型,对电针预防大鼠EMs的效应及其可能的机制进行了有益探索,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物中心[SYXK(沪)2006-0001]提供,上海市斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK(沪)2003-0003]生产,健康的清洁级雌性成熟未交配同一动情周期的SD大鼠50只,体重为(200±20)g。

1.2 预防干预用品与药物

苏州医疗用品厂有限公司出品的华佗牌无菌针灸针(0.25 mm×25 mm)、G6805-1A型电针治疗仪、塞莱西布胶囊(国药准字J20030098,0.2 g/片,批号BK070711)、阿纳曲唑片(进口药品注册证号H20050214,1.0 mg/片,批号ET969)、盐酸氯胺酮注射液(2 mL含0.1 g,批号071223)、生理盐水(0.9%氯化钠注射液,500 mL/瓶,批号080222)。

1.3 仪器设备

BIO-RAD Model 680酶标仪,OLYMPUS-BX51型显微照相系统,PERKIN ELMER ABI7000型实时荧光定量PCR仪,SIGMA 3K15低温冷冻离心机。

1.4 试剂

抗大鼠COX-2抗体(abcam:ab23672,Lot.#E 560404,1:40)、相应二抗、抗体稀释液(北京博奥森生物技术有限公司,Lot.#E080805)、脱蜡修复液(上海复旦临床病理诊断中心生产,批号200813)、DAB显色试剂(上海长岛生物技术有限公司,批号2008072)、PBS Buffer(Gene Tech,批号230707)、COX-2 ELISA试剂盒(美国ADL公司,批号20071020)、COX-2 mRNA检测试剂盒(广州中山大学达安基因公司,批号20081003)等。

1.5 分组与模型制作

将100只大鼠随机分为假手术组16只、去卵巢组16只、造模组68只,在动情期,造模组参照Jones法[5]进行手术造模,手术在无菌条件下进行,以2%盐酸氯胺酮(4 mL/kg)腹腔注射麻醉,将大鼠固定于手术板上,腹部剪毛,皮肤常规消毒后,于腹中线耻骨联合上1 cm处做2～3 cm长的纵行切口,打开腹腔结扎左侧子宫局部血管及需切除的子宫段两端,切下左侧子宫角长约1 cm置于生理盐水中,纵行切开并将子宫内膜与肌层分离,剪成5 mm×5 mm的内膜组织片段,令其表面上皮对着腹壁,用5-0号真丝缝合线缝于腹壁上,分层关闭腹腔。假手术组进行假手术,开腹方法同造模组,用血管钳夹持牵拉子宫角。去卵巢组进行手术切除双侧卵巢,开腹方法同造模组,切除双侧卵巢。术后常规饲养7 d,模型建立后将造模组再次随机分为电针组17只、COX-2抑制剂组17只、P450arom抑制剂组17只、模型组17只,共6组。

1.6 治疗及对照处理

假手术组、去卵巢组和模型组进行捆绑固定和生理盐水灌胃,电针组进行捆绑电针和生理盐水灌胃,药物组进行捆绑固定和药物生理盐水混悬液灌胃。

电针治疗具体操作为,捆绑固定后,以毫针刺入单侧血海与三阴交穴(取穴方法及大鼠穴位定位,参照文献[6]),接电针治疗仪,采用疏密波,电流强度为0.3～0.6 mA,治疗15 min。单侧每日1次,次日换另一侧穴位,双侧交替治疗。

灌胃参照《动物实验方法学》[7]。生理盐水灌胃根据大鼠体重,按照10 mL/kg计算灌胃量;药物生理盐水混悬液灌胃根据成人药物剂量换算大鼠等效剂量,塞莱西布5 mg/kg,阿纳曲唑0.1 mg/kg,并根据大鼠体重,按照10 mL/kg计算灌胃量,每次灌胃前将配制好的混悬液颠倒混匀。

疗程均为每日1次,6 d为1个疗程,疗程间隔1 d,治疗2个疗程(2星期)后处死1批,余治疗4个疗程(4星期)。

1.7 取材与指标检测

疗程结束后,分别于第2星期与第4星期后在动情期将大鼠开腹,腹主动脉采血处死,3000 rpm离心后取血清;观察子宫、卵巢及异位囊肿的大体形态,并用双脚圆规和直尺测量异位囊肿长、宽、高三径,计算平均值;取在位内膜组织和异位内膜组织,部分置于0.8 mL冻存管－80℃保存,部分用10%福尔马林溶液固定。

1.7.1 ELISA法检测血清中COX-2分子表达水平

血清中COX-2分子表达水平检测采用酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbentassy,ELISA),按照COX-2 ELISA试剂盒说明书操作。

1.7.2 IHC检测在位与异位内膜组织中COX-2蛋白表达水平

在位内膜与异位内膜组织中COX-2蛋白表达水平检测采用免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)。取10%福尔马林溶液固定组织,脱水,石蜡包埋,5mm连续切片,抗大鼠COX-2抗体浓度1:40,脱蜡修复液热修复,DAB显色,苏木素复染,健康雌性SD大鼠肺脏为阳性对照,用抗体稀释液代替一抗作为阴性对照。COX-2主要表达于子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞的细胞浆中,以胞浆呈棕黄色为阳性。免疫组化阳性计数方法,采用双盲法,任取连续4个高倍(×400)视野计数阳性细胞个数,然后取平均值,即为该组织切片的阳性细胞数,设定5个评分等级,0为0个,1为1～20个,2为21～40个,3为41～60个,4为＞60个。

1.7.3 FQ-PCR检测在位与异位内膜组织中COX-2 mRNA表达水平

在位内膜与异位内膜组织中COX-2 mRNA表达水平的检测采用荧光定量聚合酶链反应法(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)。取冻存的异位内膜组织打碎匀浆,用一步法抽提总RNA,PCR扩增由广州中山大学达安基因公司合成,上游5’-CYYGCTGTTCCCACCCATGT-3’,下游5’-ATCCTGTCCGGGTACAATCG-3’;PCR产物502bp;内参GAPDH引物,上游5’-CCGAGGGCCCACTAAAGG-3’,下游5’-GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3’,PCR产物306bp。总RNA的提取,Trizol提取异位内膜组织总RNA;RT的提取,取4mL RNA样品(阴性对照为4mL Trizol),加入5×逆转录buffer 4mL,上游引物F 0.4mL,下游引物R 0.4mL,dNTPs 0.2mL,逆转录酶MMLV 1mL,DEPC水10mL,反应条件为37℃,1 h;PCR的提取,取cDNA产物于50mL反应体系中进行PCR扩增,该反应体系包括5×PCR buffer 10mL,外上游引物F 0.5mL,外下游引物R 0.5ml,dNTPs 0.5mL,荧光探针(避光)0.5mL,Taq酶2mL,ddH2O水31mL。PCR扩增条件为93℃ 2 min,93℃ 45 s 55℃ 1 min 10Cycle,93℃ 45 s,5℃ 1 min 30Cycle。反应在ABI7000型荧光定量PCR仪上进行,数据采用仪器自带软件ABI Prism 7000 SDS Software分析。

1.8 统计学方法

各组异位组织三径平均值、血清与组织中COX-2水平、组织中COX-2 mRNA表达的比较,采用SPSS14.0 One-Way ANOVA统计数据,以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组异位组织大体观察

由表1可见,治疗及对照处理2星期与4星期后,假手术组未见异位囊肿。2星期后,电针组、COX-2抑制剂组、P450arom抑制剂组大鼠异位囊肿大小与模型组比较,差异均无统计学意义(＞0.05),仅去卵巢组大鼠异位囊肿小于模型组(＜0.05);而4星期后,电针组、COX-2抑制剂组、去卵巢组大鼠异位囊肿大小,较模型组缩小(＜0.05或＜0.01),P450arom抑制剂组大鼠异位囊肿大小与模型组相比较,无统计学差异(＞0.05)。经4星期电针治疗后,大鼠异位囊肿大小较2星期时增长幅度较小。

表1 各组大鼠异位囊肿大小比较 (±s,mm)

注:与模型组比较1)＜0.01,2)＜0.05;与电针组比较3)＜0.05

2.2 各组大鼠血清中COX-2分子表达水平比较

由表2可见,治疗及对照处理2星期与4星期后,模型组大鼠血清中COX-2含量与各组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05或＜0.01)。经4星期电针治疗后,大鼠血清中COX-2含量明显少于治疗2星期后。

表2 各组大鼠血清中COX-2分子表达水平比较 (±s,ng/mL)

注:与模型组比较1)＜0.01,2)＜0.05;与电针组比较3)＜0.05

2.3 各组大鼠组织中COX-2蛋白表达水平比较

COX-2主要表达于间质细胞的胞浆中,以胞浆中出现明显的棕色颗粒为阳性细胞,无着色为阴性细胞,由免疫组化结果可见,假手术组子宫内膜及其他各组在位内膜较少或偶有弱表达COX-2阳性细胞,无法纳入统计。

表3 各组大鼠异位内膜组织COX-2蛋白表达水平比较 (±s,ng/mL)

注:与模型组比较1)＜0.01

由表3可见,治疗及对照处理2星期与4星期后,模型组COX-2的阳性细胞数明显高于其余各组(＜0.01);电针组、COX-2抑制剂组、P450arom抑制剂组、去卵巢组相比较,差异均无统计学意义(＞0.05)。从均数来看,随着疗程的增加,各治疗组的COX-2蛋白含量有不同程度下降,尤以4星期去卵巢组明显,且与2星期时各组相比较差异均具有统计学意义(＜0.05)。详见图1。

治疗及对照处理2星期后、4星期后假手术组子宫内膜组织与其他各组异位内膜组织中COX-2蛋白的组织分布与表达情况详见图1-图12,箭头所指为COX-2阳性表达的间质细胞。

A 2星期假手术组大鼠子宫内膜组织中COX-2蛋白表达;B 4星期假手术组大鼠子宫内膜组织中COX-2蛋白表达;C 2星期模型组大鼠异位内膜组织中COX-2蛋白表达;D 4星期模型组大鼠异位内膜组织中COX-2蛋白表达;E 2星期电针组大鼠异位内膜组织中COX-2蛋白表达;F 4星期电针组大鼠异位内膜组织中COX-2蛋白表达;G 2星期P450抑制剂组大鼠异位内膜组织中COX-2蛋白表达;H 4星期P450抑制剂组大鼠异位内膜组织中COX-2蛋白表达;I 2星期COX-2抑制剂组大鼠异位内膜组织中COX-2蛋白表达;J 4星期COX-2抑制剂组大鼠异位内膜组织中COX-2蛋白表达;K 2星期去卵巢组大鼠异位内膜组织中COX-2蛋白表达;L 4星期去卵巢组大鼠异位内膜组织中COX-2蛋白表达。IHC×400

2.4 各组大鼠组织中COX-2 mRNA表达水平比较

本实验中阴性对照扩增结果呈阴性表达,未检测到目的基因COX-2 mRNA的表达,待测标本检测到目的基因COX-2 mRNA的表达,对照内参的Ct值,进行统计分析。结果显示,在位内膜(23.96±0.99)与异位内膜(26.13±1.58)间COX-2 mRNA的表达比较明显偏低(＜0.05)。

由表4可见,在位内膜间,治疗及对照处理2星期与4星期后,模型组明显高于电针组、COX-2抑制剂组、P450arom抑制剂组、去卵巢组、假手术组(＜0.01)。4星期各组与2星期各组比较可发现各干预组与模型组在位内膜组织中COX-2 mRNA的表达均有不同程度下降,但不具有统计学差异(＞0.05)。异位内膜间,治疗及对照处理2星期与4星期后,模型组明显高于电针组、COX-2抑制剂组、P450arom抑制剂组、去卵巢组(＜0.01);与电针组比较,去卵巢组明显偏低,且差异具有统计学意义(＜0.05),与其余各组COX-2 mRNA的表达比较不具有统计学差异(＞0.05)。4星期各组与2星期各组比较可发现电针组、COX-2抑制剂组、P450arom抑制剂组和去卵巢组其COX-2 mRNA表达含量有不同程度下降,模型组异位组织中COX-2 mRNA表达4星期后较2星期时表达有所上升,但不具有统计学差异(＞0.05)。

表4 各组大鼠组织中COX-2 mRNA表达水平比较 (±s)

注:与模型组比较1)＜0.01

3 讨论

子宫内膜异位症属中医学“痛经”、“癥瘕”、“月经不调”、“不孕”范畴,病因病机多责之于血瘀,在治疗上取得了一定的成效。针灸是中医学的一大治疗手段,因其应用简便、对患者刺激较小,多年来广泛地应用于对本病的治疗中。针灸对EMs的疗效明显,多选用血海、三阴交等为治疗EMs的主穴,可以活血化瘀,疏经止痛。

本研究选取异位组织长、宽、高三径的测量结果平均值对效应进行评判,结果证实,经电针治疗的EMs大鼠,其异位囊肿生长趋于缓慢,与塞莱西布和阿纳曲唑两药相比具有相同的预防功效,提示电针与上述两药均有抑制异位囊肿生长的效应,这与针灸治疗EMs的效应结果相似[8],但目前尚未见EMs的预防治疗或电针对其预防作用的相关报道。

EMs的发病机制至今尚未明确,Sampson等[9]于1922年提出的经血逆流子宫内膜种植学说无法解释80%～90%的妇女存在经血逆流[10],却只有15%～20%的妇女发生异位症的临床现象。近年我国郎景和[11]在国际上首次提出新的EMs病因假说——在位内膜决定论(determinant of uterine eutopic endometrium),引起了国际同行的关注。他认为,在位内膜的差异是发生内异症的关键因素。COX-2能增加细胞的侵袭性,且可诱导血管形成,促进异位内膜细胞的增殖、种植和生长,在内异症患者的在位内膜中,COX-2的表达明显升高[12]。

COX-2的过表达导致PGs合成异常,刺激内膜细胞产生P450arom,合成E2,为异位内膜生长提供了激素支持。此外,COX-2还可能参与局部组织血管生成、细胞的增生和抑制免疫监督,促进了异位症的病理生理过程[13]。目前针对COX-2和P450arom已研制出相应的抑制剂,并已投入临床与COX-2和P450arom表达异常相关的疾病治疗中,如塞莱西布用于拮抗COX-2的表达,从而缓解成人骨关节炎和类风湿关节炎的症状和体征;阿纳曲唑通过抑制芳香化酶,用于乳腺癌的治疗中。

研究表明[14,15],电针可下调COX-2水平的异常升高,推测这可能是电针干预EMs发生的主要环节之一。本研究即从该角度入手,结果表明,模型组大鼠血清、异位内膜组织中COX-2含量较假手术组大鼠血清及正常内膜组织均明显升高,且在位与异位内膜组织COX-2 mRNA表达均明显增高,而经电针治疗的大鼠,其血清中、异位组织中COX-2含量明显降低,在位与异位内膜组织COX-2 mRNA表达均明显降低,与应用COX-2抑制剂和P450arom抑制剂的效应相当,且随着疗程的延长作用更明显,提示电针可能是通过调节异常升高的COX-2 mRNA水平,进而影响COX-2蛋白的合成,下调外周血和局部组织中COX-2的表达,削弱由COX-2异常表达而引起的细胞侵袭、血管形成及异位内膜细胞的增殖、种植和生长,从而预防大鼠EMs的发生与进展,李傲等[16]运用中药治疗大鼠EMs也取得了类似的效应。

本研究从动物实验的角度初步探讨了电针对大鼠EMs的预防效应及其可能的作用机制,证实电针可能是通过调节异常升高的COX-2 mRNA表达,下调COX-2水平而起到预防大鼠EMs的发生发展的效应,但该过程中尚存在许多相关因素,有待于进一步的研究探讨。

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Effect of Electroacupuncture on Cyclooxygenase-2 in Endometriosis Rats

KONG Wei-guang1, ZHANG Chun-yan2, ZHANG Shu-hui2, JIANG Wen-yan2, BING Xing-hong2, LI Lian-bo2, CHEN Yun-fei2.

1. Inner Mongolia Mongolian hospital; 2.Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Yueyang Hospital of Combined Traditional Chinese and Western Medicine,Shanghai 200437,China

To investigate the effect of electroacupuncture (EA) on cyclooxygenase-2 (COX-2) in endometriosis (EMs) rats and explore the mechanism of its action in preventing rat EMs.A rat EMs model was maded. The rats were randomly assigned to model, EA, COX-2 inhibitor, P450arom inhibitor, ovariectomy and sham operation groups. The EA group received electroacupuncture at points Xuehai(SP10) and Sanyinjiao(SP6); the COX-2 inhibitor group, an oral gavage of a suspension of Celebrex in normal saline; the P450arom inhibitor group, an oral gavage of a suspension of Anastrozole in normal saline; the ovariectomy group, surgical removal of both ovaries; the sham operation and model groups; binding fixation and an oral gavage of normal saline. All groups of rats were sacrificed after two and four weeks of treatment or control treatment. The length, width and height of the ectopic cyst were determined. An average value was calculated. The ectopic tissue was taken and examined histopathologically. The level of COX-2 in serum and the tissue and the expression of COX-2 mRNA in the tissue were measured.The average values of the three diameters of the ectopic cyst were significantly larger in the model group than in the other groups (all＜0.05) and significantly smaller in the EA group than in the model group (＜0.05). A comparison between two and four weeks in the EA group showed that the ectopic cyst grew slowly, the ectopic inner membrane tended to atrophy and part of the epithelia became necrotic. The level of COX-2 in serum and the ectopic intimal tissue and the expression of COX-2 mRNA in the ectopic intimal tissue were significantly lower in the EA group than in the model group (＜0.05). The effects became more marked as the course of treatment lengthened.Electroacupuncture may prevent the occurrence and development of EMs in rats by regulating abnormally high COX-2 mRNA levels, affecting the synthesis of COX-2 and downregulating the expression of COX-2 in peripheral blood and the local tissues.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Endometriosis; Cyclooxygenase-2; Rats

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2012.11.847

1005-0957(2012)11-0847-05

上海市卫生局科研项目资助(2008221);上海高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金资助(szy08102);上海市重点学科建设项目资助(S30303,S30304)

孔伟光(1984 - ),女,主治医师

陈云飞(1968 - ),男,研究员,研究方向为针灸免疫研究, E-mail:icyf1968@yahoo.com.cn

2012-05-23