衍生化－高效液相色谱法测定丙戊酸血清浓度＊

邹小琴，毛桂福，钟小斌，黄振光

(1.广西医科大学第一附属医院，广西 南宁 530021; 2.广西壮族自治区柳州市妇幼保健院，广西 柳州 545001)

丙戊酸钠是临床常用的抗癫痫药，在癫痫患儿的治疗过程中，通过监测血药浓度实现个体化给药可以提高癫痫的控制率[1－2]和减少不良反应。衍生化－高效液相色谱(HPLC)法[3－7]是目前国内外常用的丙戊酸血药浓度测定方法，多采用三乙胺为催化剂。本研究以氢氧化钠乙腈溶液为催化剂，建立了衍生化－HPLC法测定丙戊酸血药浓度，具有干扰少、简便快速、灵敏准确等优点，现报道如下。

1 仪器与试药

岛津LC－20AT型四元梯度高效液相色谱系统(LC－20AT泵，Rheodyne7725i型进样阀，SPD－20A紫外检测器，CTO－20A柱温箱，DGU－20A在线脱气机，日本岛津);Hangping FA1004型电子分析天平(上海天平仪器厂);XW－80型漩涡混合器(上海医科大学实验仪器厂);80－2S型台式低速离心机(上海医疗器械〈集团〉有限公司手术器械厂);L－128型氮吹仪(北京来亨科学仪器公司)。丙戊酸钠对照品(湖南湘中制药有限公司，含量为99.5%，批号为090405);环己羧酸(梯希爱＜上海＞化成工业发展有限公司，含量＞95.0%);α－溴苯乙酮(A Johnson Mathey Company，含量98%);甲醇、乙腈为色谱纯试剂，四氢呋喃、无水乙醇和乙醚等均为国产分析纯试剂，试验用水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Shim －pack CLC －C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，Shim －pack CLC －C18保护柱(10 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 －乙醇 － 四氢呋喃 － 水(57∶10∶8∶25);流速:1.1 mL/min;柱温:35 ℃;检测波长:248 nm;灵敏度:1.00 AUFS;进样量:20 μL。

2.2 溶液配制

丙戊酸对照品溶液:精密称取58.4 mg丙戊酸钠对照品，置25 mL容量瓶中，用0.2 moL/L氨水溶解并定容，得到2.01 g/L的丙戊酸贮备液，置冰箱4℃保存，临用时用水稀释成不同质量浓度的对照品溶液。

内标溶液:精密称取环己烷羧酸26.3 mg，置25 mL量瓶中，用0.2 moL/L的氨水稀释至刻度，再取该液1.0 mL，置10 mL量瓶中，用水稀释至刻度，得0.1g/L的内标溶液。

衍生化试液:称取α－溴苯乙酮63.8mg，置25mL棕色量瓶中，用乙腈稀释至刻度，即得2.5 g/L的衍生化试液，密封、冷藏保存。

碱化液:氢氧化钠 20.8 g，加水溶解，定容至500 mL，再量取该氢氧化钠溶液1.0 mL，加水5.0mL，加乙腈定容至 25.0 mL。

2.3 血样处理

精密吸取血清 50 μL，加入内标溶液 50 μL，再加 3 moL/L硫酸 50 μL，混匀;加入乙醚 2 mL涡旋提取 1 min，离心 5 min(3500 r/min)，吸取上清液至离心管中，加入碱化液70 μL和2.5g/L α－溴苯乙酮溶液 100μL，漩涡混匀，在55℃水浴反应60 min，氮气吹干，残渣用 200 μL甲醇溶解，旋涡振荡30 s。

2.4 方法学考察

专属性试验:在本试验条件下，以5人份的混合空白血清、空白血清加对照品与内标、癫痫患儿服药后的血清加内标，按2.3项下方法处理后测定，得色谱图1。可见，丙戊酸衍生物与内标衍生物分离良好，血清中无明显内源性杂质干扰峰，表明本方法有较强的专属性。丙戊酸及内标的衍生物保留时间分别为4.38 min和6.55 min。

标准曲线绘制:将丙戊酸钠贮备液用空白血清稀释成质量浓度分别为 10.0，20.1，40.1，60.2，100.4，150.5，200.7 μg/mL，按2.3项下方法处理，进样20 μL。以丙戊酸与内标衍生物峰面积之比(X)对丙戊质量酸浓度(Y)进行线性回归(加权系数1/C2)，得回归方程 Y=94.685 X －0.245，r=0.9998。结果表明，丙戊酸质量浓度在10～200 μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。最低定量质量浓度为 2 μg/mL(n=6，RSD≤6.6%)。

回收率试验:取空白血清0.05 mL，制备低、中、高3个质量浓度的丙戊酸血清样品，按2.3项下方法处理后测定6次，计算方法回收率。结果见表1。

图1 高效液相色谱图

表1 丙戊酸的回收率试验结果(，n=6)

表1 丙戊酸的回收率试验结果(，n=6)

加入量(μg/mL)10.060.2150.5测得量(μg/mL)10.00 ±0.1559.69 ±3.07155.54 ±2.66回收率(%)99.80 ± 1.5499.15 ± 5.10103.35 ± 1.77

精密度试验:取空白血清0.05 mL，制备低、中、高3个质量浓度的丙戊酸血清样品，按2.3项处理后测定，1 d内测定6次，以及1周内测定6次，计算方法的精密度。结果见表2。

衍生物稳定性试验:制备低、中、高3个质量浓度的丙戊酸血清样品，按2.3项下方法处理后室温放置。以0时测定值为100%，分别在5，10 h时进样测定。结果含量分别为(100.32±1.41)%和(100.70±2.51)%，表明丙戊酸衍生物在室温放置10 h稳定。

表2 丙戊酸的精密度试验结果(，n=6)

表2 丙戊酸的精密度试验结果(，n=6)

加入量(μg/mL)日内精密度 日间精密度10.060.2150.5测得量(μg/mL)10.00 ± 0.1559.69 ± 3.07155.54 ± 2.66 RSD(%)1.545.141.71测得量(μg/mL)9.75 ± 1.5559.59 ± 2.96152.25 ± 4.34 RSD(%)1.594.972.85

2.5 临床应用

32名服用丙戊酸钠的癫痫患儿，年龄8个月～17岁，服药剂量15～50 mg/(kg·d)，用本方法测定稳态谷浓度，结果在治疗窗(50～100 μg/mL)之内16例，高于治疗窗2例，其余低于治疗窗浓度。结果表明，患儿在服用丙戊酸治疗期间应经常监测血药浓度，才能达到个体化合理治疗的目的。

3 讨论

文献报道的HPLC法[3－6]多采用α－溴苯乙酮作衍生剂，用量100～200μg。本试验表明，衍生剂用量为200μg、三乙胺为20μL时，对高质量浓度的丙戊酸血样(200 μg/mL，血清用量为0.1 mL)，衍生程度只有82%左右，衍生化不完全，易导致测定误差。当α－溴苯乙酮用量增加至反应物总量(包括丙戊酸和三乙胺)的6倍(摩尔倍数)时，衍生反应才较完全，产率达96%以上。但是，当α－溴苯乙酮用量增加至400 μg时，柱压增加较快，易发生堵柱现象。

用三乙胺乙腈溶液作催化剂，α－溴苯乙酮用量在200μg以上时，反应产物杂质较多，基线到7.5 min后才能平稳，常常对环己羧酸内标峰有干扰。用氢氧化钠乙腈溶液作催化剂，杂质少，基线3.5 min后就很平稳，克服了用三乙胺作催化剂的缺陷。

在甲醇、水组成的流动相中加入一定量的四氢呋喃和乙醇，可加快衍生物的洗脱，缩短分析周期。本研究中建立的高效液相色谱法具有线性范围宽、简便快速、灵敏准确等优点，适用于丙戊酸的常规血药浓度监测和药物动力学研究。

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