长春新碱固体脂质纳米粒的制备工艺优化＊

夏爱晓，孙 渊，马红丹

(浙江省台州医院药剂科，浙江 台州 317000)

长春新碱(vincristin，VCR)用于治疗急性淋巴细胞性白血病，疗效较好[1]，但神经毒性大，且对光不稳定，临床使用不便。靶向制剂可降低长春新碱的神经毒性，并提高其体外稳定性，从而提高疗效，这将是今后新剂型的研究趋势。固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)能将药物包裹于类脂核中而使药物稳定性增加，并可改变被包封药物的体内分布，使药物主要在骨髓、脾、肺和肝等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，具有缓控释、靶向、低毒等优点[2－3]。笔者在单因素考察的基础上，采用L9(34)正交表设计试验，优化处方组成和制备工艺，为开发长春新碱新型制剂提供试验基础。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪，TU－1901型双光束紫外可见光分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);N4 PLUS型纳米粒度分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司);日立H－7500型透射电子显微镜(日本Hitachi公司);AF100 Scotsman型制冷机(美国斯科茨曼公司);AL104型电子天平(梅特勒－托利多仪器有限公司);SB25－120超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司);88－1型定时恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器厂);Soniprep 150型超声细胞粉碎仪(英国SANYO公司);pHS－3C pH酸度计(上海雷磁公司)。硫酸长春新碱(海南长春花药业有限公司，含量为97.7%);单硬脂酸甘油酯(上海华精生物高科技有限公司);硬脂酸(德国Cognis公司);大豆卵磷脂(杭州宏博生物工程有限公司);泊洛沙姆188(德国BASF公司);甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 长春新碱含量测定(高效液相色谱法)

2.1.1 色谱条件[4]

色谱柱:Hypersil ODS2 C18柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 －水 －三乙胺(140∶60∶1，磷酸调 pH至=7.0);流速:1.0 mL/min;检测波长:297 nm;柱温:室温;进样量:20 μL。

2.1.2 方法学考察

标准曲线绘制:称取长春新碱对照品1.00 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至刻度，作为对照品贮备液。精密量取5.0 mL置50 mL容量瓶中，用75%甲醇定容至刻度，得质量浓度为 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，5.0 μg/mL 的对照品溶液。按2.1.1项下色谱条件进样，记录峰面积，以长春新碱质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程A=12274 C －2682.3，r=0.9999(n=7)。结果表明，长春新碱质量浓度在0.5～5.0 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

回收率试验:精密量取空白固体脂质纳米粒2.0 mL共3份，置10 mL容量瓶中，加入对照品溶液适量，用75%甲醇定容，超声处理后，得质量浓度为 0.5，1.5，5.0 μg/mL 的溶液，滤过，取续滤液进样测定，计算回收率。结果表明，低、中、高3种质量浓度溶液的回收率均在98% ～102%之间，平均 RSD为1.6%，说明方法准确度良好，符合方法学要求。

精密度试验:取质量浓度为 1.0，2.0，5.0 μg/mL 的对照品溶液，分别于1 d内重复进样5次和5 d内每天进样1次。结果日内精密度的 RSD=1.18%，日间精密度的 RSD=1.38%。

2.2 包封率和载药量测定[5]

精密吸取长春新碱固体脂质纳米粒(VCR－SLN)1.0 mL，置处理过的透析袋中，两端扎紧，置50.0 mL的重蒸水中，磁力搅拌2.5 h后，精密量取透析袋外液，测定其中游离药物的含量 C1;另外精密吸取等量的VCR－SLN混悬液，75%甲醇定容至刻度，超声时纳米粒充分破碎，测定长春新碱含量 C2。包封率(EE，%)=(1－C1/C2)×100% ，载药量(DL，%)=(EE% ×Wp)/W总×100%。其中，Wp为制剂中长春新碱的含量，W总为制剂中脂质材料和药物的总质量。

2.3 单因素考察

2.3.1 载体材料筛选

精密称取基质(单硬脂酸甘油酯或硬脂酸)200.0 mg，加热溶于无水乙醇，得有机相;精密称取大豆卵磷脂100.0 mg，制成水溶液，作为内水相，第1次超声(600 W，6 min)乳化，形成W/O初乳;加外水相(含表面活性剂1%泊洛沙姆188)，第2次超声(600 W，3 min)乳化，形成W/O/W复乳，通氮气下超声挥发有机溶剂。用超声细胞破碎仪于冰浴条件、7 AM振幅下破碎10 min，再加入到稀释水相(蒸馏水0～2℃)中，即得。冰箱保存，放置1周，留样观察其稳定性。结果以单硬脂酸甘油酯为载体材料时无沉淀现象，略带蓝色乳光;以硬脂酸为载体材料时出现沉淀现象，较混浊。故选择单硬脂酸甘油酯作为载体。

2.3.2 乳化剂筛选

称取单硬脂酸甘油酯200.0 mg，共3份，加热溶于无水乙醇，得有机相，以处方量的大豆卵磷脂水溶液为内水相，第1次超声(600 W，6 min)乳化，形成W/O初乳;加外水相(含不同种类乳化剂)，第2次超声(600 W，3 min)乳化，形成W/O/W复乳，通氮气下超声挥发有机溶剂。用超声细胞破碎仪于冰浴条件、7 AM振幅下破碎10 min，再加入到稀释水相(蒸馏水0～2℃)中即得。冰箱保存，放置1周，留样观察其稳定性。结果以卵磷脂－泊洛沙姆188(1∶2)为乳化剂时溶液较透明，略带蓝色乳光;以卵磷脂－泊洛沙姆188－Tween－80(1∶2∶1)为乳化剂时溶液略呈黄色，放冷后较混浊;以卵磷脂 －泊洛沙姆188－Tween－80(1∶1∶1)为乳化剂时溶液略呈黄色，出现少许沉淀，较混浊。因此，选卵磷脂－泊洛沙姆188(1∶2)为乳化剂。

2.3.3 制备方法筛选[5－8]

热熔超声法:精密称取处方量泊洛沙姆188和Tween－80，置20.0 mL水中，超声分散均匀，得水相;称取处方量大豆卵磷脂、单硬脂酸甘油酯溶于5.0 mL无水乙醇，得有机相，75℃水浴;将水相加热到与有机相相同温度时注入有机相中，恒温搅拌，制得初乳;趁热将初乳超声，冰水浴冷却、固化2 h，过膜，即得。高温乳化－低温固化法:精密称取处方量泊洛沙姆188和Tween－80，置20.0 mL水中，超声分散均匀，得水相;称取处方量大豆卵磷脂、单硬脂酸甘油酯溶于5.0 mL无水乙醇，得有机相;有机相和水相分别水浴加热至 (75±5)℃，在有机相完全溶解为澄明液体后，搅拌(1000 r/min)下将其倾入水相中，恒温搅拌2 h，使体积挥发至原来的1/3，得初乳;将初乳倾入20.0 mL的1%泊洛沙姆188中，继续搅拌1 h，过膜，即得。

溶剂乳化－超声法:精密称取处方量泊洛沙姆188和Tween－80，置20.0 mL水中，超声分散均匀，得水相;称取处方量大豆卵磷脂、单硬脂酸甘油酯，溶于5.0 mL无水乙醇，得有机相;在超声状态下，将有机相趁热逐滴滴入水相中，通氮气超声挥尽有机溶剂制得初乳，超声细胞粉碎机分散，过膜，即得。

复乳－溶剂扩散法:精密称取处方量的单硬脂酸甘油酯、大豆卵磷脂，溶于无水乙醇为有机相，水为内水相，第一次超声乳化，形成 W/O初乳;加外水相(含表面活性剂1% 泊洛沙姆188)，第二次超声乳化，形成W/O/W复乳，然后复乳加入稀释水相(0～2℃)中，分散机分散15 min(10000 r/min)，通氮气下超声挥发有机溶剂后，用超声细胞破碎仪在7 AM振幅下破碎10 min，然后复乳加入稀释水相(0～2℃)冷却固化2 h，过膜，即得。

采用浊度法初步评价各种方法制备的VCR－SLN粒径的大小，其原理为脂质材料和乳化剂等在500～800 nm范围内几乎没有吸收，不影响透光率，因此用650 nm处的吸光度值作为体系浊度来间接反映粒子大小。在相同条件下，浊度小者其粒径较小。结果见表1。故采用复乳－溶剂扩散法制备VCR－SLN。

表1 不同制备方法结果比较

2.3.4 破碎振幅和时间考察

复乳－溶剂扩散法制备的空白固体脂质纳米粒分成10份，其中 5份分别在 3，5，8，10，15 AM 超声破碎 6 min，另 5份在 10 AM 下超声破碎时间分别为 1，3，6，8，10 min，用浊度法初步评价SLN粒子大小。确定超声破碎时间为6 min，振幅为8 AM。

2.4 VCR－SLN处方优化

在预试验及单因素考察的基础上，选择长春新碱的用量(因素A)、大豆卵磷脂的用量(因素B)、泊洛沙姆188的用量(因素C)及单硬酸酯甘油酯的用量(因素D)4个因素的3个水平，以SLN包封率、载药量和粒径为指标，优化处方[9]。因素水平见表2。根据以上各因素水平，以VCR－SLN正交L9(34)表进行9次试验，测得平均包封率为36.15%，平均载药量为1.82%，见表3。对试验结果进行直观分析可知，以包封率为衡量指标得出的最佳处方为A3B3C2D2;以粒径为衡量指标得出的最优处方为A3B3C2D1，粒径越小越好。以包封率为主要评价指标，参考粒径，综合分析，最终确定A3B3C2D2为最优处方，即单硬脂酸甘油酯80 mg，长春新碱10 mg，大豆卵磷脂100 mg，泊洛沙姆188150 mg。

表2 正交试验的因素水平表

表3 L9(34)正交试验设计及结果

2.5 性质考察

验证性试验:采用复乳－溶剂扩散法，按照优化后的处方制备3批 VCR－SLN，测定粒径、包封率和载药量，平均粒径为(153.7±3.68)nm，包封率为 (55.12 ±1.73)% ，载药量为(3.09 ±0.61)% 。该方法重现性较好。pH 为 5.69 ～6.22，符合静脉注射要求。

外观形态:取VCRSLN适量，加重蒸水稀释，滴于铜网上，用2.0% 磷钨酸进行染色，自然晾干后，透射电镜下观察纳米粒的形态和大小。透射电镜照片见图1，所得制剂为球形或类球形，外观形态较圆整。

粒度及分布:取VCRSLN混悬液，用高纯水稀释调至仪器显示电信号值，折光度为90°，采用N4 PLUS纳米粒度分析仪测定纳米粒粒径(d)。测得粒径为(153.7 ±3.68)nm(n=3)，粒度多分散性指数(PI)为0.791。

图1 VCR－SLN透射电镜照片(×100000)

3 讨论

本试验曾尝试用热熔超声法、高温乳化－低温固化法、复乳 －溶剂扩散法，溶剂乳化－超声法等不同方法制备VCRSLN，由于长春新碱为水溶性，见热和光易分解，不易采用热熔和高温等条件，最终确定复乳－溶剂扩散法，且该方法适合水溶性强药物，包封率高。若采用高压匀质机制备水溶性的SLN将更有优势。

骨架脂质的种类是SLN能否形成的关键因素。单硬脂酸甘油酯既可作为一种脂质材料，又是一种弱的W/O型乳化剂，在制备SLN初乳时，能稳定初乳。硬脂酸SLN稳定性明显低于单硬脂酸甘油SLN，可能是由于硬脂酸是直链分子结构，黏度较大，晶格的有序性较高，在贮存过程中易发生晶型转化，产生凝胶化现象[10]。

常用的乳化剂有大豆磷脂、泊洛沙姆、聚山梨酸酯等，都可用来稳定SLN，在制备复乳时，采用泊洛山姆188作为乳化剂。泊洛沙姆188有空间位阻作用，一方面可阻止纳米粒的聚集从而增加其稳定性，另一方面又有避免体内网状内皮系统吞噬的趋势[11]。细胞破碎仪破碎振幅对固体脂质纳米粒有显著影响，在单因素考察中，破碎振幅6 AM，破碎时间8 min，效果最理想，能得到蓝色乳光SLN，且形成的SLN较稳定。由正交试验结果可知，乳化剂卵磷脂的用量对SLN粒径大小影响较大。卵磷脂不仅影响SLN的粒径，对载药SLN的包封率也有较大影响[12]。

SLN包封率测定方法有葡聚糖凝胶柱法、冷冻超速离心法、微型柱法、透析法及超滤法等，其原理均为采用一定的方法使包封的药物和游离药物分离，测定包封或游离药物的浓度，计算包封率。离心法虽然简便但不可靠，不能准确评价包封率的大小。本研究也曾尝试葡聚糖凝胶柱法分离VCR－SLN中的游离药物，试验中采用蒸馏水作为洗脱剂时，由于长春新碱为水溶性，在洗脱过程中SLN在葡聚糖凝胶中容易洗脱，导致包封率过高，且操作烦琐。采用透析法测定VCR－SLN包封率，考察在透析2 h左右游离药物基本达到透析平衡，且在4 h内不发生严重渗漏。为保证透析完全而SLN不渗漏，故选择2.5 h为其透析时间。

由于长春新碱为水溶性，与脂质的结合能力较差，使得VCR－SLN的包封率低于脂溶性好的药物。对于水溶性药物，应根据所载药物的性质选择与其结合力好的脂质和乳化剂进行优化，提高药物的脂溶性，减缓药物的释放[13]。总体来说，本方法制备SLN较适合水溶性药物，适用性广泛。新型给药系统是改善长春新碱不良反应大、生物利用度低的最好方法。目前，长春新碱脂质体虽已进入了临床研究，但其临床耐受性及药物累积毒性仍需密切关注。如何使长春新碱达到更加精确的靶向治疗，进一步降低其不良反应，延长其作用时间，将是长春新碱新型给药系统不断的追求。本研究中成功制备了VCR－SLN，制备工艺简单，考察制剂质量较理想，为进一步开发疗效好、毒性低的长春新碱制剂奠定了基础。

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