肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6在高血压心肌肥厚大鼠实验中的意义

史 君 王 静 王 星 孙艳宏 范晓梅 纳仁高娃

1.内蒙古医学院基础医学院生理教研室，内蒙古 呼和浩特 010059；2.内蒙古医学院第一附属医院风湿免疫科，内蒙古 呼和浩特 010051

心肌肥厚主要是由于心脏在长期压力负荷过重的情况下，肥大的心肌需氧量增加，而冠状动脉的供血量往往不能予以满足，造成心肌缺血从而引起心肌重构，其发生的结构基础主要是心肌细胞增大和纤维化。它还是心力衰竭的早期重要病理过程，也是引起心血管疾病发生率和死亡率升高的独立危险因素[1]。近年来随着研究的不断深入，发现心肌肥厚的逆转可以降低心血管疾病的危险性[2]，且炎症因子在心肌肥厚的形成中具有重要作用[3]，因此，心肌肥厚的发生发展机制显得尤为重要，但迄今各种炎症因子在心肌肥厚发病机制中的确切作用尚不完全清楚。本实验就细胞因子中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）在高血压心肌肥厚大鼠血清和心肌中的表达变化进行研究，探讨TNF-α和IL-6在心肌肥厚中所表达的作用，为今后的研究及治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 心肌肥厚模型的制备

内蒙古大学实验动物研究中心提供的Wistar大鼠180～220g 20只，均用标准颗粒性饲料喂养。按照预期实验要求喂养1周后随机分为两组，即心肌肥厚组和假手术组，每组10只。参照Anderson方法制作压力负荷性心肌肥厚大鼠模型[4]。假手术组中，利用手术分离大鼠一小段腹主动脉后，穿过一消毒手术缝线，但不作结扎，内脏恢复原位后关闭腹腔，继续饲养。各组大鼠术后按要求饲养8周，以戊巴比妥钠麻醉后称重，断头取血，摘取心脏。测取左心室重计算心室重与体重比值（LVW/BW）作为心肌肥厚指数。

1.2 动脉收缩压（SBP）的测定

分别取各组大鼠，将其放入Power Lab系统配备的大鼠固定器内，露出鼠尾，将尾根部放在烤灯下加热5～10 min，使鼠尾动脉充分扩张后，将其穿过加压尾套并固定于鼠尾根部，使大鼠尾部腹面正中与Power lab ML125／R（澳大利亚埃德仪器有限公司生产）无创尾动脉血压测定分析系统的脉搏传感器紧密接触，然后观测系统的脉搏波形，当出现稳定的脉搏波时即可开始测定血压。动物安静后给尾套充气加压，可见脉搏波逐渐减小至消失，然后尾套开始放气，鼠套压力降低，当压力等于收缩压时，开始出现脉搏波，此点的血压值即动脉收缩压。重复测量3次，取平均值，以kPa表示。

1.3 血清TNF-α、IL-6水平的测定

术后饲养8周处死大鼠，采取断头取血法，抽取4 mL血样，然后离心分离血清，-20℃保存。测定前先置室温复融，混匀后，利用4℃ 3000 r/min离心5 min，取上清液，严格按试剂盒说明书进行（分析试剂盒由北京东雅生物技术研究所提供）加样操作。

1.4 RT-PCR法扩增大鼠TNF-α及IL-6基因

1.4.1 引物设计和合成 具体引物由上海申友生物公司合成，包括：β-actin上游引物 5-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3′；β-actin 下游引物 5′-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3′；TNF-α 上游引物 5′-TGT TGT AGC AAA CCC TCA AG-3′；TNF-α 下游引物 5′-AAG TAG ACC TGC CCA GAC T-3′；IL-6 上游引物 5′-CAC TCA CCT CTT CAG AAC GA-3′；IL-6 下游引物 5-TGG CAT TTG CAT TTG TGG TTG GGT-3′，以上使用前均稀释成 10 μmol/L。

1.4.2 实验操作步骤 取30 mg心肌组织，采用TRIZOL一步法提取组织总RNA，应用RT-PCR法检测大鼠心肌组织中IL-6及TNF-α基因的表达水平。RT-PCR试剂盒购自大连宝生物公司，按照说明书进行加样操作。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，以UVP计算机图像扫描分析系统测定电泳条带密度值，以β-actin为内参照，计算TNF-α mRNA及IL-6 mRNA的相对含量，结果以TNF-α、IL-6条带占β-actin条带密度的百分率（%）表示。

1.5 统计学方法

利用SPSS 13.0统计分析软件，经半定量处理后的实验结果以均数±标准差（）表示，组间比较采用配对t检验，确立检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌肥厚大鼠收缩压和心指数的变化

与假手术组比较，心肌肥厚组术后8周动脉收缩压升高（P ＜ 0.05），心指数明显增加（P ＜ 0.05）。 见表 1。

表1 心肌肥厚组和假手术组SBP、LVW/BW的变化（，n=10）

表1 心肌肥厚组和假手术组SBP、LVW/BW的变化（，n=10）

注：与假手术组比较，*P<0.05

组别 例数 SBP（kPa） LVW/BW（mg/g）心肌肥厚组假手术组101026.4±0.3*15.7±0.53.0±0.4*2.4±0.2

2.2 心肌肥厚大鼠血清中TNF-α、IL-6含量变化

腹主动脉部分结扎手术后8周，血清TNF-α、IL-6含量增加，与假手术组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

表2 心肌肥厚组和假手术组TNF-α、IL-6血清含量的变化（，n=10）

表2 心肌肥厚组和假手术组TNF-α、IL-6血清含量的变化（，n=10）

注：与假手术组比较，*P<0.05

组别 例数 TNF-α（μg/L） IL-6（ng/L）心肌肥厚组假手术组10103.5±0.8*1.9±0.4443.1±176.2*174.3±30.2

2.3 心肌肥厚大鼠心肌TNF-α、IL-6 mRNA表达的变化

PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，以反应条带在图像分析系统内行吸光度扫描进行半定量分析，IL-6 mRNA及TNF-α mRNA的相对含量用两者条带积分的灰度值与其相应的β-actin的灰度值之比表示。与假手术组比较，心肌肥厚组心肌的 IL-6 mRNA及 TNF-α mRNA表达增加 （P＜0.05）。 见表 3。

表3 RT-PCR检测两组心肌IL-6及TNF-α mRNA结果（，n=10）

表3 RT-PCR检测两组心肌IL-6及TNF-α mRNA结果（，n=10）

注：与假手术组比较，*P<0.05

组别 例数 IL-6 mRNA TNF-α mRNA心肌肥厚组假手术组10100.51±0.05*0.22±0.030.69±0.05*0.21±0.02

3 讨论

3.1 成功构建心肌肥厚大鼠模型

心肌肥厚是指心肌细胞体积增大和心肌纤维增生[5]，是心脏对机械牵张和神经体液刺激的一种主要反应[6]。心肌肥大起初是一种对负荷增加或损伤的代偿，但持续性心肌肥大则最终会因心功能失常而导致心力衰竭，因此探讨其机制非常重要。本实验参照Anderson方法制作压力负荷性心肌肥厚大鼠模型，选取造模8周时进行数据研究。据文献报道[7-9]，造模4周时心肌肥厚模型已经建成，造模8周时模型比较稳定。笔者在前期的实验中分别通过造模4周和8周观察到心肌肥厚组心肌细胞弥漫性肥大，畸形、核大、深染，心肌纤维走行紊乱，间质增生。本实验结果显示心肌肥厚组SBP和LVW/BW显著升高，说明成功制备心肌肥厚大鼠模型。

3.2 心肌肥厚大鼠血清和心肌中TNF-α、IL-6的水平变化及意义

TNF-α是炎性细胞因子之一，其具有多种效应，目前认为TNF-α可以诱导心肌肥厚[10]。TNF-α对心肌的作用复杂多样，可致心肌细胞凋亡[11]，也可引起心肌细胞肥大[12]。TNF对胶原纤维的生成和降解进行双向调节[13-15]。据报道[10-11]在体外培养的乳鼠和成年猫科动物的心肌细胞中，TNF-α可诱导心肌肥大。王桂君等[16]研究结果显示100 μg/L TNF-α能够诱导心肌肥大，表现为蛋白合成、蛋白含量以及细胞体积增大，并增加心肌细胞内Ca2+浓度。IL-6也是一种炎性细胞因子，可致心肌细胞肥大，还有抗凋亡的作用。体外实验中IL-6可直接引起心肌成纤维细胞胶原合成的增加。Flesh等[17]在机械张力刺激的实验中观察到中等程度的拉长心肌细胞时IL-6轻微增加，20 min后TNF-α无变化，60 min后IL-6也不再变化，而在心肌细胞严重拉长时则导致TNF-α、IL-6逐渐增加至较高水平，同时TNF-α、IL-6受体表达也增多。转基因小鼠出现明显的心肌肥厚，条件是在心脏同时过表达IL-6和IL-6受体。综上所述，炎症因子TNF-α、IL-6参与心肌肥厚过程，但这些研究多集中于离体心脏或培养的心肌细胞层面，而炎症细胞因子在疾病过程中对心脏肥大的实际效应以及在体外实验和整体动物中的参与程度和方式会有不同。本实验从整体水平出发，参照Anderson方法制作压力负荷性心肌肥厚大鼠模型，选取TNF-α、IL-6两种炎症细胞因子，观察它们在心肌肥厚大鼠血清和心肌中的表达变化。结果显示，与假手术组比较，心肌肥厚组大鼠血清TNF-α、IL-6含量增加（P<0.05）；肥厚心肌中TNF-α、IL-6 mRNA表达增加（P<0.05）。提示TNF-α、IL-6参与心肌肥厚的发生发展，其机制可能是：缩窄大鼠腹主动脉致心肌后负荷增加，从而使心脏做功增加，耗氧增多，代谢产物堆积，同时心脏神经体液等因素的激活使核因子-κB（NF-κB）、活化蛋白-1（AP-1）、信号转导活化转录因子（STAT）活化[18]，可产生一些细胞因子及无菌性炎症，其中包括TNF-α及IL-6的增加。而TNF-α及IL-6在心肌细胞上的异常表达，可刺激各种生长因子[19-20]的表达，这些生长因子作用于心肌细胞，促使其肥大[21]。实验中还观察到血清和心肌中TNF-α、IL-6水平均升高，变化一致，可能是压力负荷增加导致心肌中TNF-α、IL-6 mRNA转录及蛋白质合成增加，使得进入血液循环的TNF-α、IL-6增多，进一步刺激心肌肥厚产生。因此，从本实验的观测结果可以得知：炎性细胞因子TNF-α、IL-6参与心肌肥厚的发生与发展过程。

[1]Gardin JM，Lauer MS.Left ventricular hypertrophy：the next treatable，silent killer[J].JAMA，2004，292（19）：2396-2398.

[2]Devereux RB，Wachtell K，Gerdts E，et al.Prognostic significance of left ventricular mass change during treatment of hypertension [J].JAMA，2004，292（19）：2350-2356.

[3]Chandrasekar B，Mummidi S，Claycomb WC，et al.Interleukin-18 is a pro-hypertrophic cytokine that acts through a phosphatidylinositol 3-kinase-phosphoinositide-dependent kinase-1-Akt-GATA4 signaling pathway in cardiomyocytes[J].J Biol Chem，2005，280（6）：4553-4567.

[4]Anderson PG，Allard MF，Thomas GD，et al.Increased ischemic injury but decreased hypoxic injury in hypertrophied rat hearts[J].Circ Res，1990，67（4）：948-959.

[5]张云飞，吴先均，文秀华，等.心肌肥厚机制研究进展[J].心血管病学进展，2005，26（2）：197-200.

[6]Dorn GW.Physiologic growth and pathologic genes in cardiac development and cardiomyopathy [J].Trends Cardiovasc Med，2005，15 （5）：185-189.

[7]赵智明，张群燕，蔡辉，等.压力负荷增加大鼠模型左室肥厚的观察[J].西部医学，2010，22（1）：9-11.

[8]史君，王静，王星，等.压力超负荷心肌肥厚过程中外周血CGRP、NPY的变化[J].内蒙古医学杂志，2010，42（6）：641-644.

[9]史君，王静，王星.心肌肥厚大鼠外周血CGRP、NPY和IL-6的表达[J].中国医药导报，2011，8（10）：28-30.

[10]Nakamura K，Fushimi K，Kouchi H，et al.Inhibitory effects of antioxidants on neonatal rat cardiac myocyte hypertrophy induced by tumor necrosis factor-alpha and angiotensin Ⅱ[J].Circulation，1998，98（8）：794-799.

[11]Krown KA，Page MT，Nguyen C，et al.Tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis in cardiac myocytes.Involvement of the sphingolipid signaling cascade in cardiac cell death [J].J Clin Invest，1996，98（12）：2854-2865.

[12]Yokoyama T，Nakano M，Bednarczyk JL，et al.Tumor necrosis factoralpha provokes a hypertrophic growth response in adult cardiac myocytes[J].Circulation，1997，95（5）：1247-1252.

[13]Sarkar S，Vellaichamy E，Young D，et al.Influence of cytokines and growth factors in ANG II-mediated collagen upregulation by fibroblasts in rats：role of myocytes [J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，287（1）：H107-H117.

[14]Peng J，Gurantz D，Tran V，et al.Tumor necrosis factor-alpha-induced AT1 receptor upregulation enhances angiotensin II-mediated cardiac fibroblast responses that favor fibrosis[J].Circ Res，2002，91（12）：1119-1126.

[15]Sivasubramanian N，Coker ML，Kurrelmeyer KM，et al.Left ventricular remodeling in transgenic mice with cardiac restricted overexpression of tumor necrosis factor[J].Circulation，2001，104（7）：826-831.

[16]王桂君，姚玉胜，王洪新.Ca2+/CaMKⅡ信号通路在肿瘤坏死因子-α诱导心肌肥大中的作用[J].中国药理学通报，2010，26（3）：387-391.

[17]Flesh M，Hoper A，Dell'Italia L，et al.Activation and functional significance of the renin-angiotension system in mice with cardiac restricted overexpression of tumor necrosis factor[J].Circulation，2003，108（5）：598-604.

[18]Kawano S，Kubota T，Monden Y，et al.Blockade of NF-kappaB ameliorates myocardial hype-rtrophy in response to chronic infusion of angiotensin Ⅱ [J].Cardiovasc Res，2005，67（4）：689-698.

[19]Ramani R，Mathier M，Wang P，et al.Inhibition of tumor necrosis factor receptor-1-mediated pathways has beneficial effects in a murine model of postischemic remodeling[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，287（3）：H1369-H1377.

[20]Diwan A，Dibbs Z，Nemoto S，et al.Targeted overexpression of noncleavable and secreted forms of tumor necrosis factor provokes disparate cardiac phenotypes[J].Circulation，2004，109（2）：262-268.

[21]詹昌德.一氧化氮在防止心肌肥厚反应中的作用及其机制[J].生理科学进展，2000，31（4）：322-324.