碱性蛋白酶水解林蛙卵粕蛋白的工艺条件优化

高 冷，杨 爽，赵先花

(长春工业大学化学与生命科学学院,吉林 长春130012)

东北林蛙(Ranachensinensis)亦称蛤士蟆，广泛分布于我国东北地区，是集药、食、补于一体的珍贵经济蛙种。雌性林蛙的输卵管即蛤蟆油已载入《中国药典》，具有补肾益精、养阴润肺等功效[1]。蛤蟆油分离后的残渣中含有大量的林蛙卵，林蛙卵中蛋白含量较为丰富，含有人体营养所需的8种必需氨基酸，且富含微量元素，是一种优质的天然保健品原料[1,2]，可以通过水解制备混合氨基酸，但目前开发利用甚少，往往都被废弃掉，造成了极大浪费。

传统的氨基酸生产方法有酸法和碱法，其中酸法虽然可使林蛙卵粕蛋白水解充分，但会导致色氨酸全部破坏；而碱法能够引起消旋作用，从而降低氨基酸的营养价值[3]；酶水解反应条件温和，对氨基酸破坏小，是水解林蛙卵粕蛋白最有前途的方法。碱性蛋白酶是一类适宜在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类[4]。作者选用碱性蛋白酶对CO2超临界萃取蛤蟆油后的林蛙卵粕进行水解，并优化了水解工艺条件，拟为林蛙卵的开发利用提供参考。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

林蛙卵粕，吉林吉云鹿业发展有限公司；碱性蛋白酶，北京奥博星生物技术有限责任公司；其它试剂均为分析纯。

DK-S26型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；SH2601型精密酸度计，上海大普仪器有限公司；电子万用炉，天津泰斯特仪器有限公司；GL-21LM型离心机，星科科学仪器有限公司；90-2型恒温磁力搅拌器，上海亚荣生化仪器厂；电子天平，梅特勒-托利多仪器设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶水解流程

按4%(质量浓度，下同)称取经CO2超临界萃取蛤蟆油后的林蛙卵粕加入到蒸馏水中→调节pH值→加入2000 U·g-1的碱性蛋白酶→60 ℃恒温水浴水解120 min(保持pH值不变)→90 ℃水浴加热10 min→冷却至室温，调pH值至中性→离心(7000 r·min-1，10 min)→测定上清液水解度。

1.2.2 单因素实验

固定其它工艺条件，分别改变反应温度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃)、酶加量(1000 U·g-1、1500 U·g-1、2000 U·g-1、2500 U·g-1、3000 U·g-1)、底物浓度(3%、4%、5%、6%、7%)、反应时间(30 min、60 min、120 min、180 min、240 min)，考察其对蛋白水解度的影响。

1.2.3 正交实验

在单因素实验的基础上，选取反应温度、酶加量、底物浓度、反应时间为考察因素，以蛋白水解度为考核指标，进行L9(43)正交实验确定最佳水解条件。

1.3 分析与检测[5]

采用微量凯氏定氮法并参照GB 5009.5-85测定蛋白质(总氮)含量；采用甲醛滴定法测定氨基态氮含量。依下式计算蛋白水解度(DH)：

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 反应温度对水解度的影响(图1)

图1 反应温度对水解度的影响

由图1可知，随着反应温度的上升，水解度逐渐升高；当反应温度达到60 ℃时，水解度达到最高；当反应温度高于60 ℃后，酶逐渐变性失活，导致水解度降低。

2.1.2 酶加量对水解度的影响(图2)

图2 酶加量对水解度的影响

由图2可知，随着酶加量的增加，水解度逐渐升高；当酶加量达到2000 U·g-1后，水解度升幅趋缓。

2.1.3 底物浓度对水解度的影响(图3)

图3 底物浓度对水解度的影响

由图3可知，底物浓度在3%～4%之间时，酶与底物结合几率较低，反应速度慢，导致水解度较低；当底物浓度为4%时，水解度达到最高；底物浓度在4%～7%之间时，底物与酶分子之间接触的机会减少，影响反应速度，也使得水解度降低。

2.1.4 反应时间对水解度的影响(图4)

图4 反应时间对水解度的影响

由图4可知，反应前60 min内，水解度迅速升高；反应120 min后，水解度升幅趋缓。

2.2 正交实验结果与分析(表1)

表1 正交实验结果与分析

由表1可知，各因素对蛋白水解度的影响大小依次为A>C>D>B，即反应温度的影响最大，底物浓度次之，而后是反应时间，酶加量的影响最小；最佳水解条件为A3B2C1D2，即反应温度为60 ℃、酶加量为2000 U·g-1、底物浓度为4%、反应时间为120 min，在此条件下进行3次验证实验，水解度分别为10.19%、10.16%、10.19%，平均为10.18%。

3 结论

以碱性蛋白酶水解林蛙卵粕蛋白制备混合氨基酸，通过单因素实验和正交实验确定最佳水解条件为：反应温度60 ℃、酶加量2000 U·g-1、底物浓度4%、反应时间120 min，此时蛋白水解度为10.18%。

参考文献：

[1] 王秋雨，金莉莉，娄虹，等.蛤士蟆油和青蛙油主要营养成分的测定[J].特产研究，2003，25(4)：37-40.

[2] 王宇，尚德静，冯伯森.中国林蛙蛙卵营养成分分析[J].辽宁师范大学学报(自然科学版)，2004，27(4)：471-473.

[3] 王镜岩,朱圣庚,徐长法,等.生物化学[M].北京:高等教育出版社，2002：123-154.

[4] Rose A H.Economic Microbiology[M].London：Academic Press，1980：51-72.

[5] 李建杰，荣瑞芬.碱性蛋白酶对核桃蛋白水解条件的优化研究[J].中国食品学报，2011，11(2)：129-135.