双歧杆菌脂磷壁酸对胃癌SGC7901细胞SphK1表达的影响

刘 宁，鲁志刚

（1.乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030；2.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030；3.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨 150086）

双歧杆菌（Bifidobacterium）是人体肠道内最主要的生理性有益菌，与人体的许多病理、生理现象密切相关。双歧杆菌在体内发挥着许多重要的生理功能，如生物屏障、抗衰老、改善乳糖消化不良和营养免疫等，其中抗肿瘤作用是最受关注的功能之中。双歧杆菌活体、灭活菌体、完整的细胞壁肽多糖、胞外多糖及细菌素等均有较高的抗肿瘤活性。脂磷壁酸（Lipoteichoic acid，LTA）是普遍存在于革兰氏阳性菌细胞壁中的一种成分。目前国内对双歧杆菌研究的较多，主要集中在免疫激活、抗突变、抗衰老、粘附及肿瘤等方面[1]。

鞘磷脂（Sphingolipid）是所有真核生物的细胞膜中普遍存在的组分。在鞘磷脂类物质的代谢中，神经酰胺（Ceramide，Cer）是一种细胞凋亡的诱导分子，细胞内Cer水平升高能直接导致细胞凋亡；而其下游代谢产物1-磷酸鞘氨醇（S1P）则可以通过多种途径抑制凋亡、促进存活，它们之间相对平衡决定细胞增殖或死亡。鞘氨醇激酶 1（Sphingosine kinase 1，SphK1）是这种动态平衡的关键调节者，同时其自身也是一种癌基因[2]。

本研究从鞘磷脂信号通路出发，应用RTPCR和Western blot探讨双歧杆菌LTA对胃癌SGC7901细胞内SphK1表达是否具有抑制作用，为阐明脂磷壁酸抑制胃癌的机理作进一步的探讨，同时也为发现肿瘤治疗的有效靶标提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

双歧杆菌LTA的制备参考乐军等的方法[3]，用非离子型去垢剂Triton X-114提取，通过DEAESephacel阴离子交换色谱纯化；胃癌SGC7901细胞株（购自哈尔滨医科大学）；Trizol（购自Invitrogen公司）；RT-PCR反转录试剂盒（购自北京天根公司）；SphK1和GAPDH引物序列由北京三博远志生物技术有限责任公司合成；兔源SphK1抗体（一抗）（购自Cell Signaling Technology）；辣根过氧化物酶标记的IgG（二抗）（来自于北京中杉金桥公司）；ECL发光检测试剂盒（购自南京凯基生物）；RPMI 1640（购自Invitrogen公司）；胎牛血清购自杭州四季青。

1.2 方法

1.2.1 半定量RT-PCR检测SphK1 mRNA表达

引物用Primer5设计完成，序列如下：SphK1 Forward∶5'TGGATGGTCAGCGGTTGC 3'，Reverse∶5'CTGGGAATGTCACTTTATTTGGAT 3'，扩增片断为348 bp；GAPDH Forward∶5'TCCCATCACCATCTTC CAG 3'， Reverse∶5'ATGAGTCCTTCCACGATACC 3'，扩增片断为309 bp。

细胞经0、200、500 μg·mL-1LTA处理72 h后收集细胞并加入1 mL Trizol进行总RNA的提取，用分光光度计根据OD260和OD280进行RNA浓度的测定。随后根据逆转录试剂盒进行cDNA的合成，反应体系为20 μL，包括：2 μL 10 × RT Mix，2 μL超纯dNTP，2 μL Oligo-dT15，1 μL逆转录酶，3 μL Rnase-free水，10 μL模板RNA。PCR反应体系为12.5 μL Master Mix，上下游引物各1 μL，cDNA模板5 μL，补充ddH2O至25 μL。扩增条件为：95℃5 min;95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。取 PCR 产物 5 μL 与 1 μL 6×Loading Buffer混合上样于1%琼脂糖凝胶，100 mA，电泳40 min后于紫外凝胶成像系统下观察结果并成像。灰度分析使用Image J软件。

1.2.2 Western blot检测SphK1蛋白表达

细胞经 0，200，500 μg·mL-1LTA 处理 72 h后，用预冷的PBS洗两次，用细胞裂解液提取总蛋白。BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定，调整蛋白量为20～25与5×SDS上样缓冲液以4∶1的比例混匀，煮沸变性5 min。12 000 g离心取上清于10%SDS-PAGE进行蛋白分离。电泳条件为浓缩胶80 V，分离胶120 V。随后将蛋白转印至硝酸纤维素（NC）膜上，用含5%的脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h。按说明书比例稀释一抗，将膜在4℃杂交过夜，然后用TBST洗去多余未结合的抗体，室温洗涤3次，每次15 min。随后用二抗室温摇动1～2 h进行结合，用TBST洗膜3次去掉多余抗体，每次15 min。最后用增强型化学发光剂（ECL）于暗室中进行曝光及显影定影，将胶片扫描成像，进行灰度分析。以α-tubulin作为内参进行检测。

细胞裂解液的组分为：20 mmol·L-1Tris，pH 7.4；20%甘油；1 mmol·L-1β-巯基乙醇；1 mmol·L-1EDTA；5 mmol·L-1原钒酸钠；15 mmol·L-1NaF；40 mmol·L-1β-甘油磷酸；10 μg·mL-1亮肽素和抑肽酶；1 mol·L-1PMSF（临用前补加）。

1.2.3 统计学分析

每个试验均重复3次，结果用均值±标准差（Mean±SD）形式表示。与对照组的比较采用非配对t检验，以P＜0.05为差异显著。统计分析及作图使用OriginPro 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 双歧杆菌LTA对SGC7901细胞内SphK1基因表达的影响

图1是分别用 0，200，500 μg·mL-1处理72 h后SGC7901细胞内SphK1基因和GAPDH表达的结果。利用Image J进行灰度分析，SphK1条带灰度值除以GAPDH条带灰度值为SphK1相对表达量（Relative Expression，R.E.），结果如下：

对照：1.23±0.04；200 μg·mL-1LTA处理：0.54±0.01；500 μg·mL-1LTA 处理：0.20±0.02。结果表明LTA对SGC7901胃癌细胞内SphK1基因有明显的抑制作用（P＜0.01），高浓度LTA抑制作用更大（见图1、2）。

图1 RT-PCR检测LTA处理72 h后SphK1基因表达Fig.1 SphK1 gene expression by RT-PCR after treatment with LTA for 72 h

图2 LTA处理72 h后SphK1基因相对表达量Fig.2 Relative expression of SphK1 gene after treatment with LTA for 72 h

2.2 双歧杆菌LTA对SGC7901细胞内SphK1蛋白表达的影响

LTA处理72 h后用Western Blot检测SGC7901细胞内SphK1蛋白如图3所示，经灰度分析结果如下：对照组为0.91±0.03，200 μg·mL-1LTA处理组为0.82±0.04，500 μg·mL-1LTA处理组为0.49±0.02（见图3、4）。

图3 LTA处理72 h后的SphK1蛋白表达Fig.3 SphK1 protein expressions after treatment with LTA for 72 h

图4 LTA处理72 h后SphK1蛋白相对表达量Fig.4 Relative expression of SphK1 protein after treatment with LTA for 72 h

3 讨论

双歧杆菌的表面分子LTA对多种体外培养的肿瘤细胞都具有直接的生长抑制作用，并能诱导肿瘤细胞凋亡和分化，国内对其作用机制研究较多。研究显示LTA对胃癌SGC7901细胞的增殖有抑制作用，并随着其浓度升高而增强；利用TUNEL法观察LTA处理后的细胞，出现了凋亡现象（数据未显示）。由于鞘磷脂信号在细胞凋亡中的作用逐渐被研究证实，LTA诱导SGC7901细胞调亡通过抑制这一通路实现。

鞘磷脂代谢物在介导癌细胞存活、死亡和分化的信号途径中起关键作用。Cer和S1P之间比例形成的“鞘磷脂变阻器”决定了一个细胞是死亡还是存活。SphK1是最重要并直接调节这些鞘磷脂信使的介导者[4]，同时其自身也是一种癌基因。研究发现SphK1 mRNA在许多肿瘤组织和细胞中都有高表达[5]，使得它成为一种公认的治疗癌症的鞘标。最新的研究表明SphK1表达的高低与胃癌的发展和较低的患者存活率相关[6]，因此抑制SphK1表达是发挥抗肿瘤作用的机制所在，也是进行新型药物开发的有力支持。目前一些具有药理活性的复合物已经被发现或分离出来，其中一些来源于微生物[7-8]，还有一些是合成的鞘磷脂类似物[2,9]。

本研究利用不同浓度LTA处理胃癌SGC7901细胞后检测其SphK1基因和蛋白表达情况。结果显示200、500 μg·mL-1的LTA对SphK1的基因和蛋白表达均具有明显的抑制作用，且500 μg·mL-1LTA抑制作用更强。研究结果表明，双歧杆菌LTA能够抑制胃癌SGC7901细胞内SphK1基因和蛋白表达，且浓度越高抑制作用越强。抑制的结果是一方面可以有效地抑制促存活的S1P的生成，增加促凋亡的Cer的生成；另一方面，由于SphK1自身也是一种癌基因，抑制其表达能够从根本上抑制这一信号通路，最终的结果是促使细胞走向凋亡。研究结果印证并初步解释了双歧杆菌LTA抑制SGC7901细胞增殖及诱导凋亡的作用。本研究在一定程度上证明LTA作为一种天然产物有希望成为癌症治疗物质，更重要的是为SphK1信号通路作为治疗癌症的靶标提供有力支持。对于LTA抑制SphK1同时是否影响其他信号通路，还需进一步研究。

[1]刘春梅,魏华,郭亮,等.双歧杆菌脂磷壁酸生物学活性研究进展[J].天然产物研究与开发,2007,19∶905-909,916.

[2]Bektas M,Johnson S P,Poe W E,et al.A sphingosine kinase inhibitor induces cell death in temozolomide resistant glioblastoma cells[J].Cancer Chemoth Pharmacol,2009,64(5)∶1053-1058.

[3]乐军,胡宏.非离子型去垢剂TritonX-114提取两歧双歧杆菌的脂磷壁酸[J].中国微生态学杂志,1997,9(4)∶5-8.

[4]Maceyka M,Payne S G,Milstien S,et al.Sphingosine kinase,sphingosine-1-phosphate,and apoptosis[J].Biochim Biophys Acta,2002,(2-3)∶193-201.

[5]French K J,Schrecengost R S,Lee B D,et al.Discovery and evaluation of inhibitors of human sphingosine kinase[J].Cancer Res,2003,63(18)∶5962-5969.

[6]Li W,Yu C P,Xia J T,et al.Sphingosine kinase 1 is associated with gastric cancer progression and poor survival of patients[J].Clin Cancer Res,2009,15(4)∶1393-1399.

[7]Kono K,Sugiura M,Kohama T.Inhibition of recombinant sphingosine kinases by novel inhibitors of microbial origin,F-12509A and B-5354c[J].J Antibiot(Tokyo),2002,55(1)∶99-103.

[8]Kono K,Tanaka M,Mizuno T,et al.B-535a,b and c,new sphingosine kinase inhibitors,produced by a marine bacterium;taxonomy,fermentation,isolation,physico-chemical properties and structure determination[J].J Antibiot(Tokyo),2000,53(8)∶753-758.

[9]Kim J,Kim Y,Inagaki Y,et al.Synthesis and evaluation of sphingoid analogs as inhibitors of sphingosine kinases[J].Bioorg Med Chem,2005,13(10)∶3475-3485.