响应面法优化玉竹多糖表面活性剂协助提取条件

杨静娟，钟世安

(中南大学 化学与化工学院，湖南 长沙，410083)

玉竹为百合科黄精属植物玉竹 Polygonatum odoratum (Mill) Druce的干燥根茎，属药食两用植物，味甘平，性微寒，具有滋阴润燥、养胃生津之功效[1]。而玉竹提取物多糖具有降血糖、增强免疫功能、改善心血管系统、抗肿瘤、抗衰老等功能[2]，因此，开发玉竹多糖有着很好的前景。多糖是极性大分子化合物，大多采用不同温度的水、稀碱或稀盐溶液提取[3-5]，但同一原料分别用水、酸、碱、盐或酶法提取所得多糖分子量与结构是不相同的。提取液经浓缩后以甲醇或乙醇、丙酮等溶剂沉淀析出得多糖。除了传统的水提取外，近年来研究还采用一些辅助手段提取多糖，例如超声波辅助提取法[6-7]、微波辅助提取[8-9]等方法。韩刚等在 50%乙醇中加入 0.5%的十二烷基磺酸钠(SDS)使中药姜黄中姜黄素的提取率增加了 16%；加入 0.8%的 SDS 使大黄中总蒽醌的提取率增加了20%。用水煮醇沉淀法提取黄芩苷，加入吐温-80，使其提取率也得到了提高[10-11]。使用丙烯酸、丙烯酸丁酯和苯乙烯的共聚物CPS 表面活性剂，在没有有机溶剂存在的条件下乳液萃取番茄红素，然后破乳使番茄红素析出，番茄红素的萃取效果与使用 1，2-二氯乙烷等溶剂相同[12]，基于这些启发，本文作者利用水和表面活性剂 DBS(十二烷基苯磺酸钠)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)及 OP-10(辛烷基苯酚聚氧乙烯醚-10)来提取玉竹多糖，在单因素实验中分别考察了表面活性剂的用量、提取温度、提取时间、料液比以及提取次数对多糖提取率的影响。在单因素实验结果基础上以玉竹多糖提取温度、提取时间和料液比3个因素与玉竹多糖提取产量进行响应面实验设计，优化玉竹提取条件。通过 Design Expert 软件对实验数据进行回归分析,预测玉竹多糖提取的最优产率[13-15]。

1 实验

1.1 材料与仪器

原料：玉竹，购买于长沙市大药房；试剂：去离子水；表面活性剂DBS，CTAB，OP-10，无水乙醇，正丁醇，辛烷，正己烷，异丁醇等试剂均为分析纯。

设备：R201旋转蒸发仪，上海申科器械研究所生产；TGL-16G离心机，上海安亭科学厂生产；DZF-6021真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 不同表面活性剂协助提取玉竹多糖及最佳表面活性剂的确定

称取5.0 g晒干粉碎的玉竹根茎，与100.0 mL的去离子水和一定量的表面活性剂在 85 ℃恒温水浴条件下进行玉竹多糖的提取。表面活性剂分别为DBS，CTAB和 OP-10。表面活性剂的用量与相应的多糖的产量见表 1～3，其中玉竹多糖产量的测定采用的是苯酚硫酸法，以葡萄糖为对照品，利用其标准溶液绘制标准曲线，以浓度与吸光度作线性回归，回归方程A=0.011 5C+0.002 3，γ=0.999 3，12.30～43.01 μg 范围内线性关系良好，同样利用紫外-可见分光光度法测定玉竹多糖样品溶液的吸光度，从标准曲线上读出样品溶液的中多糖含量，进而计算玉竹多糖的提取率[16]。

1.2.2 单因素实验提取玉竹多糖

从表1～3的结果可以看出：最有效的表面活性剂为DBS，且在其用量为0.60 g/100 mL水(质量分数为0.6%)时获得最高产量的玉竹多糖。为了进一步探索提高玉竹多糖的提取率，以下实验都选择0.6% DBS的溶液为提取剂。

称取一定量的干燥粉碎的玉竹根茎与 0.6%DBS溶液混合，料液比(体积与质量比)分别定位5，10，15与20 mL/g，在提取温度为70，80，90和100 ℃，提取时间为0.5，1.0，1.5与2.0 h条件下进行玉竹多糖的提取。

在单因素的最优提取条件下，分次浸提玉竹多糖，依次收集提取液，直至浸取液无色，比较其提取率。提取次数为1～4次[17]。

1.2.3 响应面实验提取玉竹多糖

根据单因素实验结果，以玉竹多糖提取温度(X1)、提取时间(X2)、料液比(X3) 3个因素与玉竹多糖产量进行响应面实验设计，优化玉竹多糖提取条件。通过Design Expert 7.0 软件对实验数据进行回归分析，预测玉竹多糖提取的最优提取参数。

2 结果与讨论

2.1 不同种类表面活性剂对玉竹多糖提取率的影响

表1～3显示了3种表面活性剂的用量及其相应的多糖产量。由表1～3可以看出：3种表面活性剂都能有效提高多糖的产量，且随着表面活性剂用量的增加多糖的产量也会增加。但表面活性剂DBS较之CTAB与OP-10能更有效，且在用量为0.6 g时，多糖的产量达到最高值0.45 g，此时多糖提取率为9%，比只用纯水作提取剂时(4%)提高了 125%。但同时也看到当表面活性剂的用量超过一定范围时多糖的产量反而有所下降，这是因为在溶液中表面活性剂的浓度超过其临界浓度时就会以胶束的形式存在，且表面活性剂的浓度越大，胶束也就越大，而溶液中游离的表面活性剂反而越少，所以多糖的产量也会下降。

表1 表面活性剂DBS对玉竹多糖提取产量的影响Table 1 Effect of CTAB on yield of polygonatum polysaccharides (85℃, 1:20)

2.2 提取温度对玉竹多糖提取率的影响

提取温度在70～90 ℃范围内，玉竹多糖提取量呈上升的趋势见图 1(a)，温度超过 90 ℃时，多糖产量反而有所下降。其原因是在较低提取温度时多糖的溶出速率缓慢，而在较高提取温度时多糖的溶出加速，但过高的温度会破坏多糖的结构，使其产量有所下降。因此，玉竹多糖的最佳提取温度为90 ℃。

2.3 提取时间对玉竹多糖提取率的影响

由图1(b)可知：提取时间在0.5～1.5 h范围内，玉竹多糖提取产量不断提高，当提取时间超过1.5 h时，原料中多糖的溶出量达到平衡，多糖提取产量无显著变化。从生产成本考虑，提取时间越长，能耗越大，故提取时间以1.5 h为宜。

表2 表面活性剂CTAB对玉竹多糖提取产量的影响Table 2 Effect of CTAB on yield of polygonatum polysaccharides (85℃, 1:20)

表3 表面活性剂OP-10对玉竹多糖提取产量的影响Table 3 Effect of OP-10 on yield of polygonatum polysaccharides (85℃, 1: 20)

图1 提取温度(a)、提取时间(b)、料液比(c)以及提取次数(d)对玉竹多糖产量的影响Fig.1 Effects of extracting temperature (a), extracting time (b), ratio of 0.6%DBS solution to raw material (c) and extracting times(d) on yield of polygonatum polysaccharides

2.4 料液比对玉竹多糖提取率的影响

由图 1(c)可知：料液比在10～20范围内，玉竹多糖提取产量显著提高，其原因可能是随着料液比的增加多糖的传质动力也增加，使得原料中更多的多糖融入提取剂中[18]。当料液比超过20 mL/g时，多糖的提取产量没有显著变化，因此，玉竹多糖提取最佳料液比为20 mL/g。

2.5 提取次数对玉竹多糖提取率的影响

从图1(d)可知：玉竹多糖的提取次数越多，其提取产率越高。第4次与第3次的多糖产率没有显著差异，从生产成本考虑，提取次数越多，能耗越大，同时在多糖纯化和浓缩时会造成部分多糖流失而降低成品得率，故提取次数以3次为宜。

2.6 响应面分析实验

对玉竹多糖提取温度(X1)、提取时间(X2)和料液比(X3)进行了三因素三水平的响应面分析实验，实验设计与结果见表 4。利用 Design Expert 7.0中Box-Behnken软件对表4数据进行二次多元回归拟合，得到玉竹多糖提取产量预测值Y对编码自变量X1，X2和X3的二次多项回归方程：

对上述回归模型进行方差分析，结果见表 5。由表 5可见：模型是显著的(P＜0.001)，其决定系数为0.982，说明该模型能够解释98.2%的变化且对玉竹多糖提取产量的分析和预测具有指导意义。此外，在P=0.05水平上对多糖的提取率影响高度显著的因素是X1的一次作用与X3的一次作用以及X1的二次作用以及X3的二次作用。

表4 响应面分析方案与实验结果Table 4 Experimental design and extraction rate of PPS with Box-Behnken software

表5 回归模型方差分析Table 5 Regression coefficients estimate and their significance test for quadratic polynomial model

2.7 玉竹多糖提取率响应面优化

利用Design Expert 软件对表4 数据进行二次多元回归拟合，所得的二次回归方程的响应面及其等高线见图 2～4。

提取温度和提取时间的交互作用对玉竹多糖提取产量的影响非常显著(见图2)。等高线的形状反映出交互效应的强弱大小，椭圆表示两因素交互作用显著[19]。玉竹多糖的产量随着提取温度的提高和提取时间的加长有一个急剧增加的趋势。提取温度较低时，要想得到较高产量的多糖必须加长提取时间，提取温度较高时，在较短的提取时间内就可以得到较高产量的多糖。由此可见：适当提高提取温度，缩短提取时间可以提高玉竹多糖的提取率。

从图3可以看出：在提取时间为1.5 h时，提取温度与料液比对玉竹多糖提取产量的交互作用也是较为显著的。温度低于 90 ℃时，需要加大料液比才能提高多糖产量，当温度处在90～92.5 ℃之间时，玉竹多糖产量随料液比变化的影响不明显，高于92.5 ℃，又会随着料液比的增大而增加，但是当料液比固定时，随着温度的进一步提高，多糖的产量会降低，这是因为在过高温度下，多糖分子结构受到了破坏而容易分解。

图2 提取温度和提取时间的交互作用对玉竹多糖提取产率的影响Fig.2 Effects of interaction of extracting temperature and extracting time on yield of polygonatum polysaccharides

图3 提取温度与料液比的交互作用对玉竹多糖产率的影响Fig.3 Effects of extracting temperature and ratio of 0.6% DBS solution to raw material on yield of polygonatum polysaccharides

图4 提取时间与料液比的交互作用对玉竹多糖产率的影响Fig.4 Effects of extracting time and ratio of 0.6% DBS solution to raw material on yield of polygonatum polysaccharides

提取温度为 90 ℃，提取时间和料液比对玉竹多糖产量的交互作用很显著(见图4)。多糖的产量随着料液比的增加和提取时间的加长成直线增加趋势，其原因是溶剂分子量的增加会影响多糖分子的扩散与糊化程度，从而影响原料的流变性能，原料中的多糖可以更加紧密的与溶剂分子结合，这种结合使玉竹多糖的产量得到了提高[20]。

2.8 实验性验证

在提取温度为90 ℃、提取时间为1.5 h、料液比为 20 mL/g的最佳单因素条件下玉竹多糖的产率为10.87%，而通过对玉竹多糖提取产量的二次多项数学模型解逆矩阵，得出玉竹多糖在提取温度为92 ℃、提取时间为1.61 h、料液比为19.93 mL/g的条件下，其最大提取产率预测值为11.11%，在此条件下的提取产量比单因素组合的最佳提取条件下的产量高出2.2%。

3 结论

(1) 本研究借助多种表面活性剂(DBS，CTAB和OP-10)表面活性剂协助提取玉竹多糖，使玉竹多糖的提取率得到了大大提高。在提取温度为 85 ℃，料液比为20 mL/g时，质量分数为0.6%的DBS溶液使多糖提取率达到最高值(9%)，比只用纯水做提取剂时(4%)提高了125%。

(2) 利用表面响应法优化玉竹多糖提取参数，建立的玉竹多糖提取产率的二次多项数学模型具有显著性(P＜0.001)，其决定系数为0.982，预测到最佳提取条件为：提取温度 92 ℃，提取时间 1.61 h，料液比19.93 mL/g，此条件下玉竹根茎中多糖提取产率高达11.11%。

[1] 谢建军, 胡蔓菁, 孙桂菊, 等. 玉竹多糖提取工艺的优化[J].江苏中医药, 2009, 41(10): 59-60.XIE Jian-jun, HU Man-jing, SUN Gui-ju, et al. Optimization of extraction process of polysaccharides from polygonatum[J].Jiangsu Traditional Chinese Medicine, 2009, 41(10): 59-60.

[2] 梁海霞, 李焕德. 玉竹的药理活性研究进展[J]. 中南药学,2008, 6(3): 342-344.LIANG Hai-xia, LI Huan-de. Advances in the pharmacological activity of polygonatum[J]. Central South Pharmacology, 2008,6(3): 342-344.

[3] GUO Xia, ZHOU Xiang, SUN Min. Optimization of extraction process by response surface methodology and preliminary characterization of polysaccharides from Phellinus igniarius[J].Carbohydrate Polymers, 2010, 80(2): 344-349.

[4] LIU Ji-cheng, MIAO Shu, WEN Xian-chun, et al. Optimization of polysaccharides extraction from the fruiting bodies of Agaricus blazei Murill using response surface methodology(RSM)[J]. Carbohydrate Polymers, 2009, 78(4): 704-709.

[5] Lucimara M, Cordeiro C, Philip A I, et al. Comparative studies of the polysaccharides from species of the genus Ramalina-lichenized fungi-of three distinct habitats[J].Phytochemistry, 2003, 63(8): 967-975.

[6] Hromádková Z, Ebringerová A, Valachovic P. Ultrasoundassisted extraction of water-soluble polysaccharides from the roots of valerian (Valeriana officinalis L)[J]. Uitrasonics Sonochemistry, 2002, 9(1): 37-44.

[7] CHEN Xiao-ping, WANG Wan-xiang, LI Shui-bing, et al.Optimization of ultrasound-assisted extraction of Lingzhi polysaccharides using response surface methodology and its inhibitory effect on cervical cancer cells[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 80(3): 944-948.

[8] WANG Jun-long, ZHANG Ji, ZHAO Bao-tang, et al. A comparison study on microwave-assisted extraction of Potentilla anserine L. Polysaccharides with conventional method: Molecule weight and antioxidant activities evaluation[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 80(1): 84-93.

[9] CHEN Yi-yong, GU Xiao-hong, HUANG Sheng-quan, et al.Optimization of ultrasonic/microwave assisted extraction(UMAE) of polysaccharides from Inonotus obliquus and evaluation of its anti-tumor activities[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2010, 46(4): 429-435.

[10] 韩刚, 韩学成, 张卫国. 表面活性剂提高姜黄素提取率的研究[J]. 中成药, 2004, 26(4): 269-271.HAN Gang, HAN Xue-cheng, ZHANG Wei-guo. Study on applying surface active agent to increase extractive rate of curcumin[J]. Chinese Traditional Patent Medicine, 2004, 26(4):269-271.

[11] 韩刚, 史国友, 孙海燕, 等. 表面活性剂对大黄总蒽醌提取率的影响[J]. 中草药, 2005, 36(10): 1498-1499.HAN Gang, SHI Guo-you, SUN Hai-yan, et al. Effect of surfactant on extractive rate of anthraquinones from phubarb[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2005, 36(10):1498-1499.

[12] ZHU Jie, ZHANG Ming-jie, LIU Qing-wei. Interdisciplinary chemistry experiment: An environmentally benign extraction of lycopene[J]. Journal of Chemical Education, 2008, 85(2):256-257.

[13] LIANG Ren-jie. Optimization of extraction process of Glycyrrhiza glabra polysaccharides by response surface methodology[J]. Carbohydrate Polymers, 2008, 74(4): 858-861.

[14] QIAO De-liang, HU Bing, GAN Dan, et al. Extraction optimized by using response surface methodology, purification and preliminary characterization of polysaccharides from Hyriopsis cumingii[J]. Carbohydrate Polymers, 2009, 76(3): 422-429.

[15] LI Mei, WANG Zhen-chang, DAI Hao-jie, et al. Response surface optimization of polysaccharides extraction from liriope roots and its modulatory effect on sjogren syndrome[J].Carbohydrate Polymers, 2009, 45(3): 284-288.

[16] 黄艳萍, 张玉祥, 刘浩, 等. 玉竹中多糖的超声波提取工艺研究[J]. 中国医药导报, 2006, 12(12): 70-71.HUANG Yan-ping, ZHANG Yu-xiang, LIU Hao, et al. Study on the ultrasonic extraction techniques for the polysaccharide in polygonatum odoratum[J]. Guiding Journal of TCM, 2006,12(12): 70-71.

[17] 杨振东. 用响应面法优化紫玉米芯花色苷提取工艺参数[J].中国调味品, 2009, 34(11): 47-57.YANG Zhen-dong. Optimization of extraction technique of purple corn cob pigments by response surface methodology[J].China Condiment, 2009, 34(11): 47-57.

[18] Abdelkader B, Alain D, Hamid K, et al. Isolation and structural characterization of hemicelluloses from palm of Phoenix dactylifera L.[J]. Carbohydrate Polymers, 2007, 68(3): 601-608.

[19] 王允祥, 吕凤霞, 陆兆新. 杯伞发酵培养基的响应面法优化研究[J]. 南京农业大学学报, 2004, 27(3): 89-94.WANG Yun-xiang, LV Feng-xia, LU Zhao-xin. Optimization of cultivation medium Clitocybe sp. AS 5.112 for the extracellular polysaccharides production and mycelial growth by response surface methodology[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2004, 27(3): 89-94.

[20] LIU Yu-hong, WANG Feng-shan. Structural characterization of an active polysaccharide from Phellinus ribis[J]. Carbohydrate Polymers, 2007, 70(4): 386-392.