壳聚糖对人子宫内膜癌细胞影响的实验研究

吕 芳 潘 宇 魏 勉 顾方乐 王大新 张晓梅

江苏省苏北人民医院妇产科生殖医学中心(扬州，225001)

随着体内支架植入术的广泛应用，近年已经研制出多种药物涂层支架，在支架外可涂覆一层膜使药物缓慢释放，达到治疗和预防目的，避免了二次手术给患者带来的痛苦［1］。壳聚糖是天然多糖，无毒无刺激，具有良好的组织相容性和生物可降解性，在体内可被溶菌酶缓慢催化水解为低聚糖被人体吸收，是一种新型的医用生物材料，应用于体内安全［2，3］。壳聚糖做为一种生物可降解纳米缓释聚合物的出现，为宫内节育产品的材质设计提供了新契机。体外实验和动物实验表明壳聚糖具有选择性抑制成纤维细胞、平滑肌细胞增殖［4］和促进表皮细胞［5］、内皮细胞的生长［6］，但对人子宫内膜细胞的影响尚未见文献报道。本实验旨在研究壳聚糖在体外环境下对人子宫内膜细胞的影响，为壳聚糖作为宫内节育器材料提供实验依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器

RPMI 1640培养基(sigma公司，美国)、胰蛋白酶(difco公司，美国)、胎牛血清(hyclone公司，美国)、阿霉素(浙江海正药业公司)、噻唑蓝(MTT，sigma公司，美国)、壳聚糖(济南海得贝海洋生物工程有限公司)、碘化丙锭(BD公司，美国)、5－溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU，sigma公司，美国)。细胞增殖ELISA试剂盒(Roche公司，瑞士)、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。人子宫内膜癌Ishikawa细胞株(上海复祥生物科技有限公司)，分光光度计(Shimadzu公司，日本)，流式细胞仪(BD公司，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 壳聚糖溶液配制取壳聚糖干粉2.0g，加入蒸馏水100ml，再加入冰醋酸1ml，磁力搅拌24h，待壳聚糖完全溶解后，10 000rpm/min离心20min，取上清，得到浓度为20 000μg/ml的壳聚糖储存液。使用RPMI 1640培养液配制最终浓度为0.01、0.1、1、10、50、100μg/ml的壳聚糖工作液。

1.2.2 细胞培养与分组处理Ishikawa细胞使用10%胎牛血清 －RPMI 1640培养基，以1×104细胞/孔接种于96孔培养板，于37℃、5%CO2条件下进行常规培养，每2天更换新鲜培养基。收集处于对数生长期的细胞，培养24h后进行分组处理。细胞中分别添加不同浓度壳聚糖溶液培养做为实验组;分别以20%胎牛血清和5μg/ml阿霉素溶液进行培养为阳性对照组，常规培养细胞为空白对照组。各组细胞继续培养48h后进行实验测试。

1.2.3 细胞增殖检测采用MTT法检测细胞增殖。在培养细胞中加入20μl的MTT(5mg/ml)，继续培养4h，吸弃MTT溶液，每孔加入150μl的二甲基亚砜(DMSO)，震荡10min，使结晶物充分溶解，570nm波长，分光光度计检测光吸收值，每组重复3次。计算细胞相对增殖率［(各组细胞光密度值/空白对照组细胞光密度值)×100］;分析细胞增殖率和细胞毒性分级［7］，当相对细胞增值率值分别为≥100%、75% ～99%、50% ～74%、25% ～49%、1% ～24%、0时，毒性反应分别为0级、1级、2级、3级、4级、5级。0级和1级为无毒性，3级～5级为有毒性，2级时结合细胞形态观察判定有无毒性。

1.2.4 细胞DNA合成速率检测采用BrdU掺入法进行DNA合成速率的检测。在各组培养细胞中加入10μM BrdU，孵育8h后，分光光度计450nm波长检测光吸收(OD)值，每组重复3次取平均值。

1.2.5 细胞周期的检测方法收集各组培养细胞，离心后弃上清，PBS洗3次，300μl PBS重悬细胞，加入700μl预冷无水乙醇，3 000rpm/min离心5min，弃上清，加入800μl碘化丙锭(PI)，轻轻混匀，流式细胞仪检测细胞周期。

1.3 统计学方法

2 实验结果

2.1 壳聚糖对细胞增殖和细胞毒性的影响

不同浓度壳聚糖处理细胞48h后，与空白对照组比较，细胞的增殖能力在壳聚糖浓度≤10μg/ml的各组无明显变化(P＞0.05)，在50μg/ml组和100μg/ml组具有促进作用(t=2.423，P=0.036 和t=5.520，P=0.002);在 20% 胎牛血清组细胞增殖率增加(t=3.023，P=0.020)，在阿霉素组则降低(t=78.15，P＜0.01)。分析细胞毒性分级显示，壳聚糖和胎牛血清组均无细胞毒性产生，阿霉素具有明显的细胞毒性。见表1。

2.2 壳聚糖对细胞DNA合成速率的影响

由表1可见，与空白对照组比较，壳聚糖浓度≤10μg/ml的4组和20%胎牛血清组细胞的DNA合成速率均无差异(P＞0.05);壳聚糖浓度为50μg/ml和100μg/ml时对细胞内DNA合成具有促进作用(t=3.605，P=0.011;t=4.338，P=0.006);阿霉素组 DNA 明显受到抑制(t=13.902，P ＜0.01)。

2.3 壳聚糖对细胞周期的影响

根据细胞增殖能力影响结果，当壳聚糖浓度≤10μg/ml时细胞增值率无明显变化，≥50μg/ml壳聚糖对细胞增殖具有明显促进作用。为了进一步评估壳聚糖对细胞活性的影响，选择壳聚糖浓度≤10μg/ml的4组细胞进行细胞周期分析，结果见图1。与空白对照组和20%胎牛血清阳性对照组比较，≤10μg/ml壳聚糖4组G1期、G2期、S期的细胞均无明显变化(P＞0.05)，各期细胞所占比率分别在46.36% ～49.52%、11.76% ～16.36%、37.22% ～40.15%;阿霉素组G1期和 G2期明显延长，分别占59.1%和40.9%，而S期细胞极低。表明壳聚糖浓度≤10μg/ml时对细胞周期没有明显影响。

表1 各组细胞增殖率及毒性结果(±s)

表1 各组细胞增殖率及毒性结果(±s)

与空白对照组比较*P＜0.05 ＊＊P＜0.01

组 别 细胞增殖率OD值%毒性分级 DNA合成速率OD值空白对照组 1.154 ±0.019 100.0 0 级0.731 ±0.0721壳聚糖实验组(μg/ml)0.01 1.172 ±0.044 101.6 0 级 0.713 ±0.056 0.1 1.144 ±0.065 99.1 1 级 0.787 ±0.010 1.0 1.191 ±0.054 103.2 0 级 0.744 ±0.014 10 1.203 ±0.040 104.2 0 级 0.789 ±0.016 50 1.230 ±0.050* 106.5 0 级 0.919 ±0.055*100 1.289 ±0.038＊＊ 111.7 0 级 0.964 ±0.059＊＊胎牛血清阳性对照组 1.421±0.151* 123.1 0级 0.718±0.060阿霉素组 0.286±0.005＊＊ 24.8 3级 0.145±0.011＊＊

图1 壳聚糖对细胞周期影响的变化曲线

3 讨论

壳聚糖是利用虾蟹外壳废弃物质制成的天然高分子化合物，具有良好的生物相容性，在人体内可被完全吸收，无毒副作用，具有广阔的临床应用前景［8］。目前的研究发现，壳聚糖具有优良的药剂辅料性质，如生物相容性、可降解性、吸湿性等，并且壳聚糖本身具有一定的抗菌、消炎、止血等作用，因此在药物制剂中的应用越来越广泛［9］。

Ishikawa细胞具有子宫内膜间质细胞和上皮细胞的混合特征，被认为是研究正常子宫内膜功能的良好模型［10］。并且Ishikawa细胞表达与正常子宫内膜相同的许多酶和结构蛋白［11］，这些分子随着功能性类固醇类激素受体的变化而变化，因此Ishikawa细胞可以用于人子宫内膜内分泌信号通路的相关研究［12］。

本研究首先通过MTT检测了壳聚糖对Ishikawa细胞毒性的影响，其次使用BrdU掺入法和流式细胞仪检测壳聚糖对Ishikawa细胞周期的变化。实验结果显示，壳聚糖浓度≤100μg/ml时对Ishikawa细胞均无明显的细胞毒性;≤10μg/ml对Ishikawa细胞的增殖生长、DNA合成与细胞周期均无明显影响应，既不引起子宫内膜异常增殖，也不抑制子宫内膜细胞增殖。将壳聚糖用于IUD生物缓释载药材料将有望为开发出新一代生物降解型载药聚合物宫内节育器产品带来新的选择。

1 汪民武，王大新，赵炯心，等.关于阿奇霉素纳米粒子载药量的研究［J］.材料导报，2010，24(12):45－47.

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3 Bajaj G，Van Alstine WG，Yeo Y.Zwitterionic chitosan derivative，a new biocompatible pharmaceutical excipient，prevents endotoxin－mediated cytokine release［J］.PLoS One，2012，7(1):e30899.

4 费瑜，刘贤英，李桂荣，等.水溶性壳聚糖对血管平滑肌细胞增殖的影响［J］.东北师大学报(自然科学版)，2010，42(4):121－125.

5 邓守恒，杨敬宁，曹凤军，等.硒化壳聚糖对体外培养表皮细胞增殖的影响［J］.山西医科大学学报，2009，40(11):982－985.

6 许庆，陈静，罗祥林，等.壳聚糖单体对内皮细胞血管化功能的影响［J］.中国组织工程研究与临床康复，2010，14(51):9545－9548.

7 盛伟华，龚爱华，李明忠，等.几种丝素材料细胞毒性的实验研究［J］.中国生物医学工程学报，2005，24(3):277－281.

8 李若慧，张雪，单丹彤，等.壳聚糖的生物相容性［J］.中国组织工程研究，2012，16(12):2237 －2240.

9 吴丽颖，刘建芳，侯艳宁.壳聚糖在药物制剂中的应用［J］.解放军医药杂志，2012，24(4):48 －52.

10 Nishida M，Kasahara K，Kanekoet M，et al.Establishment of a new human endometrial adenocarcinoma cell line，Ishikawa cells，containing estrogen and progesterone receptors［J］.Nihon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi，1985，37(7):1103 －1111.

11 Castelbaum AJ，Ying L，Somkutiet SG，et al.Characterization of integrin expression in a well differentiated endometrial adenocarcinoma cell line(Ishikawa)［J］.J Clin Endocrinol Metab，1997，82(1):136－142.

12 Lessey BA，Ilesanmi AO，Castelbaum AJ，et al.Characterization of the functional progesterone receptor in an endometrial adenocarcinoma cell line(Ishikawa):progesterone－induced expression of the alpha1 integrin［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，1996，59(1):31 －39.