吡格列酮对糖尿病大鼠氧化应激和肾组织基质积聚的影响

张 红，胡长军，陆卫平

（南京医科大学附属淮安第一医院内分泌科，江苏 淮安 223300）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的慢性微血管并发症之一，也是慢性肾功能衰竭和需要肾脏替代治疗的终末期肾衰（end－stage renal disease，ESRD）的主要原因。细胞外基质蛋白（extracellular matrix，ECM）在肾小球及间质的积聚是DN发生的中心环节，从而导致肾小球纤维化硬化的发生［1］。Brownlee［2］认为氧化应激是引起糖尿病慢性并发症的主要发病机制之一，在DN的发生、发展中起重要作用。研究表明，噻唑烷二酮类（thiazolidinediones，TZDs）药物对DN具有直接有益的保护作用，本实验以此为依据从生化指标、氧化应激、形态学改变、基质积聚表达等方面，研究吡格列酮（pioglitazone，PIO）对链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病大鼠肾脏保护作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 STZ购自Sigma公司，丙二醛（malondialdehyde，MAD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、铜锌超氧化物歧化酶（Cu，Zn superoxide dismutase；Cu，Zn－SOD）由南京建成生物工程研究所提供，大鼠Ⅳ型胶原（typeⅣCollagen，Col－Ⅳ）抗体购自美国Santa Cruz公司，免疫组化二步法试剂盒购自北京中山公司，吡格列酮由江苏恒瑞医药公司提供。

1.2 方法

1.2.1 模型建立和分组 STZ 60mg／kg一次性腹腔注射，48 h测尾静脉血糖，持续大于16.7mmol／L者确定为糖尿病大鼠；将SD大鼠分3组:正常对照组（NC组，15只）；糖尿病对照组（DM 组，15只）；糖尿病PIO治疗组（DP组，15只）:20mg·kg－1·d－1PIO无菌水混悬液灌胃［3］，其余予无菌水灌胃。

1.2.2 标本收集检测 8周末代谢笼收集24h尿，检测尿清蛋白（microalbuminuria，MAU），麻醉腹主动脉采血，检测糖化血红蛋白（HbA1c）、尿素氮（BUN）。肾指数（KI）以肾质量／体质量（g／kg）表示。肾脏称质量后用于 MAD、CAT、Cu及Zn－SOD检测及电镜观察、蜡块制备。化学比色法测定MDA、CAT及Cu，Zn－SOD含量及活性，步骤按说明书操作。

1.2.3 免疫组化 Col－Ⅳ采用二步法，步骤按说明书进行，显色强度用LEICA Qwin图像系统分析，以光密度（OD）值表示。

1.3 统计学处理 用SPSS13.0统计软件进行资料分析，计量数据用表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生化指标及氧化应激水平结果 DM及DP组HbA1c较NC组升高，DP组与DM组HbA1c比较差异无统计学意义（P＞0.05）。DM 组及DP组的KI、BUN、MAU均高于 NC组，DP组显著低于DM组（P＜0.01），见表1。

2.2 肾组织氧化应激水平变化 PIO治疗后的大鼠，肾组织CAT和Cu，Zn－SOD水平升高，而 MAD水平被抑制（P＜0.01），见表2。

2.3 肾组织病理学变化 光镜下DM组大鼠肾小球细胞数显著增多，肾小球毛细血管狭窄甚至闭塞，电镜下见肾小球基底膜增厚，系膜细胞增生，足突微绒毛化，PIO治疗后病理学损害明显改善，见图1、2。

2.4 免疫组化 DM组大鼠肾Col－Ⅳ在肾小球肾小管表达增多，DP组大鼠Col－Ⅳ明显减低（P＜0.01），见图3。染色强度OD值，见表3。

表1 各组大鼠HbA1c、BUN、KI、MAU比较（）

表1 各组大鼠HbA1c、BUN、KI、MAU比较（）

＊:P＜0.01，与NC组比较；▲:P＜0.01，与DM组比较。

组别 HbA1c（%）BUN（mmol／L） KI（g／kg） MAU（μg／mg）NC组3.54±0.455.76±1.033.52±0.398.05±2.05 DM组 7.60±1.19＊18.80±2.87＊ 8.82±1.30＊118.24±9.48＊DP组 7.41±0.9411.05±2.24▲ 5.56±0.83▲ 68.23±9.64▲

表2 各组大鼠 M AD、CAT、Cu－ZnSOD比较（）

表2 各组大鼠 M AD、CAT、Cu－ZnSOD比较（）

＊:P＜0.01，与NC组比较；▲:P＜0.01，与DM组比较。

组别 MAD（mmol／mg） CAT（U／mg） Cu，Zn－SOD（U／mg）NC组6.21±1.56 730.0±69.5 50.5±4.9 DM组 11.35±2.77＊ 516.3±59.8＊ 39.6±5.2＊DP组 7.81±1.94▲ 688.5±78.2▲ 46.7±6.1▲

表3 各组大鼠肾组织Ⅳ型胶原蛋白表达比较（）

表3 各组大鼠肾组织Ⅳ型胶原蛋白表达比较（）

＊:P＜0.01，与NC组比较；▲:P＜0.01，与DM组比较。

组别C－ⅣNC组33.22±5.15 DM 组 70.34±9.51＊DP组 36.97±7.32▲

图1 各组大鼠肾组织病理形态学变化（HE染色，×400）

图2 各组大鼠肾小球超微结构（×6000）

图3 大鼠肾组织Col－Ⅳ免疫组化表达变化（二步法，×400）

3 讨 论

随着人们生活水平的提高及人口老龄化生活方式转变等，糖尿病的患病率迅速增加，其中1／3的患者最终进展为DN，由此也导致了ESRD的大量增长［4－5］。但是DN发病机制尚未完全清楚，其中高血糖对DN的影响一直以来是人们关注的重要领域，长期高血糖引起的多元醇代谢通路的激活、蛋白质的非酶糖化、蛋白激酶C过度活化、己糖途径激活、葡萄糖转运蛋白活化等从不同作用环节促进了DN的病理进程［6－7］。反应性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是上述途径发挥作用的主要分子链，它通过促进ECM过表达，加速肾脏纤维化，最终导致 ESRD 的发生［8－9］。

ROS是超氧阴离子（O2－）、过氧化氢（H2O2）和羟自由基（OH－）等活性含氧化合物的总称，氧化应激（oxidative stress，OS）时ROS产生增多和／或清除减少，导致其在体内蓄积而引起的分子、细胞和机体的损伤［10］。MAD是反应机体氧化能力的重要指标，在DN中的作用主要是与糖基化胶原蛋白发生交联反应，进而影响胶原蛋白的降解，使ECM积聚增加，加速DN进展［11］。Col－Ⅳ是肾小球基底膜和ECM的主要成分，故本实验选择Col－Ⅳ作为DN基质积聚的一项研究指标［12］。SOD是体内最重要的抗氧化酶之一，是清除ROS的第一道防线，Cu，Zn－SOD存在于细胞质中，其主要作用是清除 O2－，防止生物膜脂质过氧化损伤，故SOD水平的高低可间接反映机体的抗氧化能力。CAT活性的降低可间接反映H2O2生成的减少，是反映机体抗氧化能力的重要指标之一［13］。

临床上PIO主要用于治疗2型糖尿病，它通过结合并激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR－γ）进而调节与胰岛素效应有关的多种基因的转录，以此达到降低血糖的目的。PPAR－γ除在胰岛素主要作用靶组织表达外，还表达于单核／吞噬细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肾小球系膜细胞及上皮细胞等，它可以抑制成纤维细胞增殖和巨噬细胞浸润、抑制炎症介质，调节系膜细胞增殖和分化、抑制血管活性物质合成，提示PIO直接的肾脏保护作用可能与上述机制有关［14］。

本试验结果显示，8周时DM组大鼠的MAU、KI、BUN增加（P＜0.01），即出现肾脏肥大，尿蛋白排泄增加，病理形态上显示毛细血管狭窄或闭塞，系膜细胞增生，肾小球基底膜增厚，足突微绒毛化，说明模型已出现DN典型的功能改变及病理学异常。DM组大鼠肾组织中MDA含量明显高于NC组，而Cu，Zn－SOD和CAT活性明显下降（P＜0.01），说明糖尿病大鼠肾组织氧化效应增强，抗氧化能力下降，即氧化应激反应出现。PIO治疗8周后的DP组大鼠，肾脏肥大减轻，尿蛋白排泄减少，病理学损害改善，同时MAD水平下降，Cu，Zn－SOD和CAT活性增强（P＜0.01）。免疫组化结果显示，DM组大鼠Col－Ⅳ蛋白在肾小球表达增多，PIO治疗后，Col－Ⅳ表达减少（P＜0.01），而 HbA1c并未降低（P＞0.05），说明PIO治疗可通过下调 MDA水平、提高Cu，Zn－SOD和CAT的活性，有效地抑制基质积聚，进而延缓DN病理学进程，而且这种作用并未依赖血糖水平的降低。

综上所述，PIO具有DN的保护作用，它可以通过抑制氧化应激介导的基质积聚而实现，且这种作用并不依赖血糖水平的降低，具有直接的肾脏保护作用。研究表明，TZDs同时具有控制血糖、调节血压、改善血脂、抑制细胞周期进展、调节细胞因子及炎性因子表达等作用［15］。关于PIO的DN保护作用需要更多的研究证实。

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