基质金属蛋白酶－2组织抑制剂基因多态性与蛋白质表达的关系

王 伟，徐 敏

(1.咸宁学院临床医学院内科学教研室，湖北咸宁437100;2.湖北省鄂钢医院)

蛋白酶/抗蛋白酶失衡假说已成为公认的与肺疾病(如慢性阻塞性肺病、肺纤维化等)发病有关的机制之一［1］。有研究显示［2］，TIMP－2 基因 +853位点多态性与慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的易感性有关，特别是当吸烟者存在等位基因G时易患COPD。本研究通过分析肺组织中TIMP－2基因多态性的改变与蛋白质表达的关系，进一步探讨TIMP－2基因多态性的改变在COPD发病中的作用。

1 对象和方法

1.1 对象

选择肺大泡、肺癌手术切除的无病变肺组织29份，其中肺大泡7例、肺癌22例，标本立即置于－70℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 组织基因组DNA提取

取冻存的肺组织标本30mg，采用组织DNA提取试剂盒(美国Omega公司)提取组织基因组DNA。

1.2.2 聚合酶链反应

引物(北京博大泰克公司合成):上游:5＇－GCCCAGGGTGTTCTGGATGG－ 3 ＇，下 游:5 ＇－CTCCGGCTGATGGCCCCACT－3＇，PCR 反应体系为 50μl，取洁净 PCR管依次加入 10×buffer 5μl，dNTP(10mmol/L)2μl，MgCl2(25mmol/L)3μl，上游引物(10mmol/L)1μl，下游引物(10mmol/L)1μl，模板DNA 2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)2U(Promega公司提供)，ddH2O 35.6μl，PCR 反应条件:预变性94℃ 3min;变性 94℃ 45s;退火 66℃ 45s;72℃1min;共30个循环;再72℃延伸10min。

1.2.3 酶切反应

采用内切酶BsrI(NEB公司)对+853位点PCR产物进行酶切，酶切产物在2.5%琼脂糖凝胶电泳，染色，在凝胶成像系统分析结果确定基因型。

1.2.4 TIMP－2 蛋白的检测

免疫组化SP法检测肺组织TIMP－2蛋白的表达:鼠抗人TIMP－2单克隆抗体，免疫组化SP试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司，标本经10%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，包埋组织标本作5μm连续切片，采用高温直接煮沸法修复抗原，免疫组化SP法染色按照试剂说明书进行。用已知的阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定

在高倍显微镜(10×40)下观察细胞着色程度，进行半定量分级。TIMP－2均以实质细胞胞膜或胞质出现明显的黄色或棕黄色颗粒判断为阳性着色。高倍镜下取4个不同视野，各计数200个细胞，按阳性细胞所占的百分率分为(+～+++)。无阳性细胞为阴性(－);阳性细胞＜30%为(+)，呈浅黄色;阳性细胞占30% ～50%为(++)，呈棕黄色;阳性细胞 ＞50%为(+++)，呈棕褐色。用HMIAS－2000型高清晰度彩色医学图文分析系统对切片染色进行定量检测，测定肺组织阳性着色的TIMP－2蛋白积分光密度值(A值)，在相同的倍数下计算平均A值。

1.4 统计学处理

采用SPSS13.0统计学软件，频率比较采用卡方检验，蛋白定量以均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有显著性意义。

2 结果

2.1 TIMP－2基因+853位点产物PCR－RFLP结果

肺组织基因型频率分布G/G型15例(51.7%)、G/A 型 9例(31.0%)、A/A 型 5例(17.2%)。

2.2 TIMP－2 蛋白的表达

TIMP－2蛋白表达半定量分级显示G/G型阳性率26.7%、G/A型阳性率22.2%、A/A型阳性率40%，表达无差异性(P＞0.05);TIMP－2蛋白定量检测各型间亦无差异性(P＞0.05)，见表1。

3 讨论

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类能够水解细胞外基质的内肽酶，基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)是内源性的MMPs组织特异性抑制剂，能调节MMPs活性，抑制 MMPs对细胞外基质的降解。研究表明［3，4］，与肺疾病相关的 TIMPs主要为 TIMP－1 和TIMP－2，而TIMP－2在肺组织有更强的对MMPs抑制作用，故MMPs/TIMP－2平衡有利于维持肺组织的正常形态，能阻止肺疾病的发生。

1996年，Hammani等确定人类 TIMP－2基因位于人类第17号染色体长臂17q23－17q25，全长约83kb个碱基对，含有5个外显子和4个内含子;其基因多态性表现为－418位点和+853位点，TIMP－2蛋白是一种非糖基化蛋白，以1∶1形式与IV型胶原蛋白酶(MMP－2)结合从人类黑色素瘤细胞中分泌出来，分子量为21Ku，可以抑制MMPs家族所有成员的活性。以往研究显示［2］，TIMP－2基因+853位点多态性表现为G/G型、G/A型、A/A型，其中G/G型与我国中部地区慢性阻塞性肺病易感性有关，多态性的改变可能影响TIMP－2蛋白。

本研究结果显示，+853位点G/G型、G/A型、A/A型3种基因型TIMP－2蛋白表达无明显差异(P＞0.05)，说明蛋白质的表达量在3种基因型之间无差异，基因型可能与蛋白质的表达量无关。TIMP－2基因+853位点多态性与我国中部地区慢性阻塞性肺病易感性有关的机制有待进一步研究。

［1］Teramoto S，Ishii T，Yamamoto H，et al.Xenobiotic enzymes and genetics of COPD［J］.Chest，2005，127(1):408

［2］王伟，徐敏，胡克.基质金属蛋白酶－2组织抑制剂基因多态性与慢性阻塞性肺病易感性研究［J］.实用医学杂志，2009，25(22):3812

［3］Gualano RC，Vlahos R，Anderson GP.What is the contribution of respiratory viruses and lung proteases to airway remodelling in asthma and chronic obstructive pulmonary disease［J］.Pulm Pharmacol Ther，2006，19(1):18.

［4］Segura－Valdez L，Pardo A，Gaxiola M，et al.Upregulation of gelatinases A and B，collagenases 1 and 2，and increased parenchymal cell death in COPD［J］.Chest，2000，117(3):684