重组H8N4亚型禽流感病毒的拯救

崔鹤馨 ，李 沂 ，田宇飞 ，袁 森 ，凡 敏 ，靖 杰 ， 齐延新 ，郭欢欢 ，田明尧， 金宁一

（1.吉林大学畜牧兽医学院，长春1300621；2.军事医学科学院军事兽医研究所，长春 130122；3.吉林农业大学动物科技学院，长春 130118）

流感病毒是负链RNA病毒，基因组是分节段的。最初研究人员通过纯化RNPs蛋白来获得流感病毒；1989年，研究人员通过辅助病毒获得了流感病毒；1999年，Neumann等和Fodor等建立了能完全从克隆的cDNA产生流感病毒的新技术，首次通过12质粒系统拯救出流感病毒。至此，反向遗传操作技术取得了突破性进展。但当较多数量的质粒一起进入细胞并协调表达时，病毒的拯救效率会受到影响。为了减少质粒数量，2000年Hoffmann等[1]建立了双向转录表达载体的8质粒系统, 即在同一载体上实现vRNA的转录和病毒蛋白的表达。编码vRNA的cDNA正向插入到RNA聚合酶Ⅱ启动子（从人巨细胞瘤病毒CMV启动子衍化而来）和终止序列（牛生长激素poly（A）信号aⅡBGH）之间，并一起反向插入了人RNA 聚合酶Ⅰ启动子（PⅠh）和鼠RNA 聚合酶Ⅰ终止序列（tⅠ），这一系统采用共培养293T 细胞和MDCK细胞, 因为人的RNA 聚合酶I启动子只能在人源或相近种属动物细胞才能表现较高的活性。8个质粒转染真核细胞后，在同一个模板上由RNA聚合酶Ⅰ控制合成负链vRNA，由RNA聚合酶Ⅱ控制合成正链mRNA，转染的293T细胞中产生的病毒随后感染MDCK细胞并大量复制并表达蛋白质。 该系统最大的优点在于不需要构建专门的蛋白表达质粒，使得反向遗传学系统产生流感病毒的时间和成本也随之缩短和降低。另外，该系统广泛应用于多种负链RNA病毒的拯救,如狂犬病毒、牛瘟病毒、新城疫病毒、水疱性口膜炎病毒、麻疹病毒等[2-7]。本研究对CY015173的H8 HA与CY005359的N4 NA基因进行全基因合成，并依次克隆至pHW2000载体，与已经构建好的pHW2000-PA、pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-NP、pHW2000-NS 、pHW2000-M，组成8质粒的拯救系统，成功拯救了H8N4亚型流感病毒。

1 材料和方法

1.1 菌株、细胞和鸡胚 DH5α（大肠杆菌感受态）克隆载体的宿主菌，本研究室保存；SPF鸡胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；MDCK细胞和293T细胞由本研究室提供; EGFP由上海生工合成；1%鸡血红细胞。

1.2 8质粒拯救系统 pHW2000和6个质粒来自本研究室保存（pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-NP、pHW2000-M、pHW2000-NS），H8HA和N4NA基因片段由上海生工合成。

1.3 酶与试剂EcoR V、EcoR I、Hind III、SalI、KpnI、SmaI、SphI、NdeI、XhoI、BsmB I等限制性内切酶购自大连宝生物公司；质粒DNA小量和大量提取试剂盒购自爱思进生物技术有限公司；质粒回收试剂盒购自爱思进生物技术有限公司；ExTaq酶、T4 DNA 连接酶、RNase购自Promega公司；DNA Marker、Low molecular protein marker、胰蛋白胨、琼脂糖、酵母提取物购自华美生物工程公司；GeneCompanion™Ⅰ转染试剂盒购自Gene Trans公司；Opti-MEM购自大连宝生物有限公司。

1.4 pHW2000-H8和pHW2000- N4的构建及鉴定将已构建成功的pMD18-H8HA、pMD18-N4NA

转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含有氨苄的LB平板，挑取形状规则，大小均一的单菌落。用质粒小提试剂盒提取质粒，并用BsmB I酶切 pMD18-H8HA、pMD18-N4NA 和 pHW2000，酶切体系：质粒8 μL，缓冲液5 μL，BsmB I 2 μL，无菌ddH2O 35 μL。取5 μL酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察并记录结果。其余的酶切产物经酶切产物回收试剂盒纯化回收。将纯化回收的H8和N4基因及线性化载体PHW2000 用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系：载体片段2 μL、H（N）片段4 μL、T4连接酶1 μL、缓冲液2 μL、蒸馏水11 μL，16 ℃连接过夜。连接产物经转化、涂板和挑取单菌落后用质粒小提试剂盒提取重组质粒，并用BamH I和XhoI双酶切鉴定，鉴定正确的质粒送去测序，阳性重组质粒命名为pHW2000-H8和 pHW2000- N4。

1.5 重组H8N4亚型禽流感病毒的拯救 将8质粒按试剂盒说明书所要求的稀释到1μg/μL，将生长良好的MDCK和293T细胞接6孔板，当其铺满80%～90%时，开始转染。具体操作如下：在EP管架上分两排放16个EP管，在每个EP管中放300 μL Opti-MEM培养基，前8个管里放3～4 μL质粒，后8个管里放3～4 μL脂质体，混匀静置5 min。前8个管分别与后8个管的液体加在一起，混匀静置25 min。把混合好的8管液体分别加在6孔板上，每孔100 μL。6 h后每孔补加2 mL DMEM培养基，72 h后将细胞吹下和上清一起回收。将收取的细胞液接种至10日龄鸡胚尿囊腔，丢弃24 h内死亡的，72 h后收取鸡胚尿囊液。如此，在鸡胚中盲传3代。在P3实验室中收取SPF鸡胚尿囊液，按照OIE标准用1%的鸡胚红细胞做血凝试验。

1.6 重组H8N4亚型流感病毒的鉴定

1.6.1 血凝及血凝抑制实验鉴定流感病毒 血凝实验即在血凝板上的每个孔中加入25 μL的生理盐水，1号孔中加入25 μL病毒液，以此倍比稀释，最后一孔弃掉25 μL，并设不加待检病毒的红细胞对照孔，在振荡器上摇匀，置37℃温箱感作，30 min后观察结果。血凝抑制试验即将血凝实验呈阳性结果的抗原稀释成4单位抗原，然后在血凝板上的每个孔中加入25 μL的生理盐水，1号孔中加入25 μL用生理盐水5倍稀释的新鲜血清，以此倍比稀释，最后一孔弃掉25 μL，最后在每孔中加入25 μL的4单位病毒液，在振荡器上摇匀，置37℃温箱感作30 min后，每孔加入25 μL 1%红细胞悬液，再在振荡器上摇匀，置37 ℃温箱感作30 min后观察结果。

1.6.2 PCR鉴定 收集血凝试验阳性尿囊液，提取RNA反转录后，分别用NP的引物、H8的引物、N4的引物做PCR。具体体系如下：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，rTaq0.5 μL，模板0.5 μL，无菌ddH2O15.5 μL。H8上游引物序列：5'-AGCAAAAGCAGGGGTCACA-3'，下游引物序列：5'-AAAACACCCTTGTTTCTACT-3'；N4上游引物序列：5'-AGCAAAAGCAGGAGT-3'，下游引物序列：5'-AAAAAACTCCTTGTTTCTACT-3'。1.6.3 电镜法鉴定流感病毒 将血凝实验阳性尿囊液2656×g离心30 min。取上清液体10 μL 。上清液体送至电镜室经磷钨酸负染后，镜下寻找病毒颗粒并照相。

1.7 重配H8N4亚型流感病毒的生物学特性分析

1.7.1 重组病毒血凝素热稳定性测定 将H8N4重组病毒分装至5个EP管中，400 μL/管，分别放入56 ℃水浴中，放置的时间分别为0、15、30、60、90 min，然后迅速在4 ℃冰箱中放置10 min。按OIE标准测量其血凝效价。热稳定性划分标准为：56 ℃水浴条件下以下降2个滴度为标准，15 min以内的为热不稳定型，15～30 min之间的为中等耐热型，30 min以上的为热稳定型。

1.7.2 重组病毒的耐酸性测定 将H8N4重组病毒分装至2个EP管内，1 mL/管。1号EP管加入pH值为4的盐酸溶液，室温作用3 h，再用NaHCO3调节pH值至7；2号EP管加入生理盐水室温作用3 h。将两管内液体分别接种10日龄SPF鸡胚，72 h后收集尿囊液，测其效价。

1.7.3 重组病毒对乙醚和氯仿的敏感性试验 将H8N4重组病毒分装到3个EP管内，1号EP管液体加入0.25 mL乙醚，室温作用3 h；2号EP管液体加入1%氯仿，室温作用3 h；3号EP管加入0.25 mL生理盐水室温作用3 h。将3个EP管内液体稀释到10 mL，分别接种10日龄SPF鸡胚，72 h后收取尿囊液，测其效价。

2 结果与讨论

2.1 重组质粒的酶切鉴定 小量提取的重组质粒pHW2000-H8和pHW2000-N4分别用限制性内切酶BamH I和XhoI在37℃水浴条件下酶切3 h，经鉴定质粒构建成功，结果如图1。

图1 pHW2000-H8 和pHW2000-N4 Bam的HI和Xho I酶切鉴定图Fig.1 pHW2000-H8 and pHW2000-N4 vector by Bam HI and Xho I

2.2 重组H8N4亚型流感病毒的鉴定

2.3.1 血凝实验及血凝抑制实验结果 血凝试验初步断定拯救是成功的，部分鸡胚尿囊液传到第三代的时候出现了阳性反应，一般在1～3个+，有1个达到了5个+。也有在第1～2代时有阳性结果，而到第3代却变成了阴性，推断可能是病毒毒力减弱；血凝抑制实验进一步验证证实了血凝试验的结果，即血凝试验呈阳性的待检样品都呈现阴性。

2.3.2 PCR法鉴定重配H8N4亚型流感病毒 用H8的上下游引物进行PCR，凝胶电泳见图2。

图2 RT-PCR鉴定拯救病毒Fig.2 Identif i cation of virus rescued by RT-PCR

图3 获救病毒的电镜照片(440 000 ×)Fig.3 The electron microscope photograph of rescued viruses(440 000 ×)

2.3.3 电镜法鉴定流感病毒 电镜照片结果显示，禽流感病毒的形态多为球状，大小约为80～120 nm，电镜下病毒囊膜表面的纤突可以清楚的看到，符合流感病毒的形态特征，见图3。

2.4 重配H8N4亚型流感病毒的生物学特性分析结果

2.4.1 热稳定性实验血凝结果 将重组病毒置于56℃水浴中，放置30 min以上的一组病毒血凝价下降了2～3个滴度，放置15～30 min的另一组病毒血凝价无明显变化。说明重配H8N4流感病毒是中等耐热性毒株。

2.4.2 耐酸性实验血凝结果 将盐酸处理过的病毒接种于10日龄SPF鸡胚，未发现血凝抑制，亦无感染，而对照组用生理盐水处理过的病毒发生了血凝抑制且效价较高，证明该病毒对酸敏感。

2.4.3 对乙醚和氯仿敏感性的实验结果 将病毒用乙醚和氯仿处理过后接种SPF鸡胚，未发现血凝抑制现象，而对照组的血凝抑制现象明显。说明该病毒对乙醚和氯仿敏感。

2.5 流感病毒亚型众多、变异频率高、重排现象较多，是唯一的能在短时间内引起世界范围大暴发的病毒，可以在各年龄段的人群中引起发病，每次流感大流行都给人类带来了巨大的灾难。传统的遗传学难以应对新出现的毒株及快速掌握其生物学特性，可导致延误防控流感的最佳时机。

本研究利用霍夫曼8质粒拯救流感病毒原理，在前人成功构建载体的研究基础上，重新构建了pHW2000-H8和pHW2000-N4质粒。通过8质粒共转染293T和MDCK细胞，收集病毒液并在SPF鸡胚中传3代。对收集的尿囊液进行血凝实验、RTPCR以及电镜观察等实验，证明H8N4亚型禽流感病毒获得成功拯救。我们所应用的8质粒系统不需要单独表达RNPs形成所必需的PB2 、PB1 、PA这三种聚合酶及NP核蛋白，而是利用一个双向转录/表达载体上的RNA 聚合酶Ⅰ、Ⅱ启动子来实现基因的转录和表达的同步完成，节省了质粒，提高了拯救的效率。

对重配H8N4流感病毒的部分生物学特性进行初步分析，结果表明拯救的H8N4流感病毒是鸡胚高复制性流感病毒，符合一般流感病毒的生物学特性。由于流感病毒的高危害性和其变异较快且各型之间又不能交叉防护，在后续的实验中，我们将把成功拯救的重配H8N4流感病毒接于动物体内，进一步研究禽流感病毒的变异机理，为流感减毒活疫苗的研制等奠定坚实的基础。

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