猪繁殖与呼吸综合征病毒强/弱毒感染PAM细胞生物学特性比较分析

朱建平，周艳君，王亚欣，虞凌雪，吴玉璐，童 武，姜一峰，朱礼倩，于 海，童光志

(中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241)

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是以妊娠母猪繁殖障碍及仔猪出现呼吸道疾病为特征的传染病[1,2]，主要是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus , PRRSV)引 起 的。PRRSV属动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒[3,4]。PRRS自被发现以来，一直是严重危害各国养猪业的一个重要疫病。

中国在1995年发现PRRS疫情，1996年首次分离获得该病病原[5]，自此该病一直持续在中国猪群中流行。2006年新的高致病性PRRSV变异株在中国出现，使得由该病原造成的疫情变得复杂和严重。高致病性PRRSV与中国2006年以前分离经典毒株相比最大的特点是存在1+29个氨基酸的缺失，同时基因组中还存在一些核苷酸的变异[6-8]。发生变异的PRRSV不仅致病性增强，而且对细胞的感染特性也发生了变化，以前报道的经典PRRSV分离株一般都是利用猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages, PAM）分离成功，而后才适应在传代细胞Marc-145细胞中培养。高致病性PRRSV分离株则与之存在明显不同，它可以直接在传代细胞Marc-145细胞中分离成功[6,7]。另外，高致病性PRRSV分离株还可以在Marc-145细胞上连续传代致弱，致弱后的毒株可以作为疫苗用于高致病性PRRS的免疫预防[9-11]，但是究竟是何原因导致同一来源的两种毒株在致病性上存在如此之大的差异，尚未见报道。由于PRRSV在体内感染的靶细胞主要是PAM，而PAM是机体内重要的免疫细胞：一方面PAM可以通过吞噬作用杀灭或清除病原体，另一方面，PAM还通过抗原递呈、分泌各种细胞因子等发挥免疫调节功能，因此在机体的免疫防御体系中具有重要作用。PRRSV可以在感染的PAM细胞中转录、复制产生子代病毒粒子[11]，那么强、弱毒在感染PAM细胞后是否也存在差异？本研究拟利用PRRSV的强毒HuN4株及其传代致弱的HuN4-F112株作为研究对象，通过比较具有不同致病性的PRRSV在感染靶细胞PAM之间的生物学特性的异同，为更加深入了解PRRSV的致病机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与实验猪 高致病性PRRSV分离株HuN4株与弱毒疫苗HuN4-F112株均由本实验室分离、传代和保存[6,7,10]；新生健康仔猪购于上海交通大学农学院实验动物中心。

1.1.2 试剂与抗体 抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体由本实验室保存[13,14]；抗GAPDH单克隆抗体购自Santa Cruz公司；山羊抗小鼠IgG荧光标记二抗购于Invitrogen公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗购于中杉金桥；胎牛血清、RPMI-1640培养基均购于GIBCO；RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购于碧云天生物技术公司；化学发光试剂SuperSignal®West Pico Chemiluminescent Substrate购于Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 PAM 的分离 选取新生的健康仔猪按照参考文献报道的方法分离猪肺泡巨噬细胞[15]。然后将灌洗出的PAM细胞通过细胞计数，将其数量调整为2×106/mL，用含10%FBS 、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基重悬细胞，以每孔2×106个细胞/60×15 mm铺培养板，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养12 h。

1.2.2 病毒感染 当PAM细胞培养密度达到95%以上时，用PBS洗涤细胞，然后分别接种103TCID50的HuN4株和HuN4-F112株。感染1 h后，弃去培养液，更换成含2%FBS的RPMI-1640培养基继续培养，并适时观察细胞病变。

1.2.3 间接免疫荧光检测 分别收获用HuN4株和HuN4-F112株感染36 h的PAM细胞，经80%的无水乙醇固定和PBS洗涤后，加入抗PRRSV N蛋白的单抗，37℃作用45 min后，经PBS洗涤3次，加入适量稀释的荧光二抗，37℃孵育45 min，PBS洗涤后，于荧光显微镜下观察检测结果。

1.2.4 Western blot分析N蛋白的表达 分别在12、24、36、48、60 h收获 HuN4株和HuN4-F112株感染的PAM细胞，用预冷的PBS（pH7.2）洗涤3次，加入含1 mmol/L PMSF的RIPA细胞裂解液，置于冰上裂解30 min，然后刮取裂解的细胞移至1.5 mL离心管中，4℃、13 000×g离心10 min，收获上清液，根据BCA试剂盒使用说明测定细胞总蛋白浓度。分别取等量的细胞总蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳进行分离，并转印到NC膜上，利用N蛋白单抗进行Western blot分析，同时用鼠抗GAPDH作为内参对照。

1.2.5 生长曲线的绘制 分别在HuN4株和HuN4-F112株感染PAM细胞和Marc-145细胞后12 、24、36、48、60 h收获病毒液，然后在Marc-145细胞上按文献报道的方法测定不同时间的病毒滴度[13]。

2 结果

2.1 细胞病变观察与IFA检测 强毒HuN4株感染PAM细胞后24 h开始出现细胞病变，48 h大量细胞破碎、脱落，出现明显的细胞病变，弱毒HuN4-F112株感染PAM细胞后48 h未出现明显的细胞病变，仅有少量细胞脱落（见图1）。利用抗PRRSV N 蛋白的单抗进行IFA检测，结果显示在强毒HuN4株感染的PAM细胞中可见到大量的特异性绿色荧光，而弱毒HuN4-F112株感染的PAM细胞中仅见到少量存在的绿色荧光（见图2）。

图1 强毒HuN4株与弱毒HuN4-F112株感染Marc-145和PAM细胞48 h后细胞病变结果(×200)Fig.1 Cell pathogenic effect of HuN4 and HuN4-F112 in Marc-145 and PAM, respectively(×200)

2.2 不同毒株感染PAM后N蛋白表达变化 对强毒HuN4株和HuN4-F112株感染PAM细胞和Marc-145细胞后不同时间病毒N蛋白表达量的变化，进行Western blot分析，结果显示，强毒HuN4株感染PAM细胞后12 h就可以检测到N蛋白，其后随着感染时间的延长，N蛋白量也逐渐增加，24～36 h表达量达到最大；而弱毒HuN4-F112株在感染PAM细胞后36 h可检测到少量N蛋白，其后表达量略有增加。在Marc-145细胞上弱毒HuN4-F112株的感染后N蛋白的表达量在感染早期则明显优于强毒株（图3）。

图2 强毒HuN4株与弱毒HuN4-F112株感染Marc-145细胞和PAM细胞后IFA检测结果（×200）Fig.2 IFA detection of HuN4 and HuN4-F112 in Marc-145 and PAM（×200）

图3 Western blot检测PRRSV感染PAM细胞与Marc-145细胞后N蛋白的表达Fig.3 Western blot detection of PRRSV N protein of HuN4 and HuN4-F112 in Marc-145 and PAM

2.3 强、弱毒株在PAM细胞上的生长特性分析利用多步法，分别绘制了强、弱毒株在PAM细胞和Marc-145细胞上的生长曲线，结果显示，在Marc-145细胞，弱毒HuN4-F112株的增殖特性显著高于强毒HuN4株，而在PAM细胞上，强毒HuN4株在感染早期的增殖能力明显高于HuN4-F112株（图4）。

图4 HuN4与HuN4-F112感染PAM细胞与Marc-145细胞生长曲线的测定Fig.4 Growth curve of HuN4 and HuN4-F112 in PAM and Marc-145, respectively

3 讨论

猪肺泡巨噬细胞（PAM）是PRRSV在猪体内感染的主要靶细胞，在体外利用细胞系培养时，非洲绿猴肾细胞系MA-104及其衍生细胞系（Marc-145和CL-2621）都能够支持PRRSV的感染与增殖[16]。其中北美洲型PRRSV对PAM比CL2621更敏感，当然也有的北美洲型PRRSV只能在CL2621细胞上复制[17]。通过上述研究，可以看出使用的高致病性PRRSV强毒HuN4株对PAM的感染性要比体外传代细胞系Marc-145细胞更为敏感，其在感染PAM后24 h就出现了明显的细胞病变，出现大量细胞的圆缩、崩解和死亡等，此时的细胞培养物中病毒粒子的含量也明显增加，病毒滴度也基本达到峰值。而在Marc-145细胞中，其增殖速度则相对迟缓一些。与此相反，弱毒HuN4-F112株对Marc-145细胞的感染性则比PAM更为敏感一些，弱毒HuN4-F112株感染Marc-145细胞后24 h就出现细胞皱缩、脱落等典型的细胞病变，病毒增殖滴度也迅速达到较高水平，而在PAM细胞上其增殖速度则较为缓慢。

本研究通过IFA试验可以看到强毒HuN4株和弱毒HuN4-F112株均可以感染PAM细胞，不同的是强毒株感染后在短时间内就可以检测到被感染细胞内产生的大量荧光，而弱毒HuN4-F112株感染细胞产生的荧光则相对要少，可见，强毒株对PAM细胞的感染性明显高于弱毒株。为了深入探讨强弱毒对PAM细胞的感染能力的差异，我们从病毒感染后核蛋白的合成水平对强弱毒之间进行了比较分析，结果显示，强毒株HuN4株的病毒核蛋白在感染PAM细胞早期就迅速达到了高峰，且显著高于弱毒；而弱毒HuN4-F112株在感染PAM细胞后36 h才检测到低水平表达的核蛋白，且维持在较低水平，由此可见强、弱毒在PAM细胞上的感染和增殖能力存在明显差异。

通过观察强、弱毒株在PAM细胞和Marc-145细胞上的生长曲线，可以看到在Marc-145细胞，弱毒HuN4-F112株的增殖特性显著高于强毒HuN4株，而在PAM细胞上，强毒HuN4株在感染早期的增殖速度明显高于HuN4-F112株。由此可见强毒HuN4株和弱毒HuN4-F112株在PAM细胞上的生长特性差异与两者对机体具有不同致病性密切相关。PAM是机体的免疫防御细胞，在宿主的天然免疫和特异性免疫中均发挥重要作用。我们推测强毒株与弱毒株之间存在明显的致病性的差异，与二者对机体内靶细胞PAM的感染能力具有直接的相关性。强毒HuN4株感染可迅速使PAM细胞遭受破坏，导致其免疫防御功能丧失，进而使机体的疾病进程加快；而弱毒株虽然可以感染PAM细胞，但是其对PAM细胞感染能力显著低于强毒株，或许这种感染能力不足以破坏其完整免疫系统，反而会激发其免疫调节功能，因此弱毒疫苗株HuN4-F112株能够为机体提供免疫保护而不会造成肺部损伤[9]。但是究竟是何原因导致弱毒株对PAM细胞的感染能力降低还需要进一步实验来确定，本研究结果的获得为我们深入探讨PRRSV强毒HuN4株与弱毒HuN4-F112株对机体致病性差异提供了理论依据。

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