血管周围脂肪组织中AngⅡ介导血管平滑肌细胞增殖的机制

史吉莹，刘唐威，杨国勋，黄江南，宋梦莹，钱静

（广西医科大学第一附属医院高血压病区，南宁 530021）

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）的增殖在血管重构的发生和发展中起主要作用［1，2］。多种生物活性物质通过不同的信号传导途径参与了VSMC的增殖过程，其中氧化应激触发的氧化还原信号途径已经成为防治血管增殖性疾病的研究方向［3，4］。我们之前的研究已证实血管周围脂肪组织（perivascular adipose tissue，PVAT）是局部的RAS系统，可产生血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ），与高血压血管重构相关。同时，PVAT也是产生活性氧物质（reactive oxygen species，ROS）的重要来源［5］，含有产生 ROS的 NAD（P）H 氧化酶系，而AngⅡ可以刺激NAD（P）H产生超氧化物。因此，本实验通过培养VSMC细胞、检测VSMC增殖指标表达来探讨在PVAT中ROS介导AngⅡ诱导VSMC增殖及迁移的可能机制。

1 材料与方法

1.1 平滑肌细胞培养

取大鼠胸主动脉环，去除血管外膜和内膜，将中膜剪成1个1 mm2大小组织块，采用贴壁法自原代细胞开始培养，置入10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中。在37℃，5%CO2培养箱中培养，用0.25%胰蛋白酶消化传代，实验选用4～10代培养细胞，细胞在光镜下呈典型峰谷状表现，α-actin检查呈阳性染色。以传代培养法调整细胞密度为1×105/mL，接种于6孔细胞培养板。

1.2 主要试剂和仪器

AngⅡ（Sigma，货号 A9525）、apocynin（Sigma，货号 A10809）、catalase（Sigma，货号 C1345）、PD98059（Sigma，货号P215）、牛磺酸（国药集团化学世界有限公司，批号 F20090223）、DTNB （Sigma，货号43760）、α-actin抗体（武汉博士德生物工程有限公司）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所）、细胞DNA含量检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）、过氧化氢检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）、流式细胞仪（美国贝克曼公司，型号LX-20）、荧光酶标仪（型号FLX800，美国）。

1.3 活性氧检测

将细胞种于6孔，板待贴壁后用无血清培养液按1∶1 000稀释DCFH-DA，使终浓度为10 μmol/L，37℃孵育20 min。用无血清培养液洗涤细胞3次，收集细胞制备成单细胞悬液。使用荧光酶标仪激发波长488 nm，发射波长525 nm，实时检测荧光的强度。

1.4 实验分组

1.4.1MTT分析法：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐检测AngⅡ诱导平滑肌细胞增殖：按照时间分为：（1）正常对照组：不含任何药物的培养液；（2）AngⅡ处理组：AngⅡ（终浓度 100 nmol/L）分别处理 12 h、24 h、48 h。按照浓度分为：（1）正常对照组：不含任何药物的培养液；（2）AngⅡ处理组：AngⅡ （终浓度分别为 1 μmol/L、100 nmol/L、10 nmol/L）处理24 h。采用MTT分析血管平滑肌细胞增殖率。

1.4.2 NADPH氧化酶抑制剂、过氧化氢酶及ERK1/2抑制剂对AngⅡ诱导平滑肌细胞增殖、H2O2及HOCL的影响：实验分组为（1）对照组：未给予任何药物处理；（2）AngⅡ处理组：AngⅡ（终浓度 100 nmol/L）处理 24 h；（3）apocynin+AngⅡ处理组：预先给予apocynin（终浓度 400 μmol/L）处理 20 min，然后 AngⅡ（终浓度 100 nmol/L）处理 24 h；（4）catalase+AngⅡ处理组：预先给予catalase（终浓度300 nmol/L）处理2 h，然后AngⅡ（终浓度100 nmol/L）处理24 h；（5）PD98059+AngⅡ处理组：同时给予 PD98059（终浓度 10 μmol/L）及 AngⅡ（终浓度 100 nmol/L）处理24 h。采用蛋白定量、流式细胞术分析血管平滑肌细胞总蛋白含量及细胞周期进程。采用比色法检测H2O2和HOCL水平。

1.5 MTT

取对数生长期的成纤维细胞，胰酶消化后制备细胞悬液，调整浓度为1×105/mL，加入96孔培养板中。待细胞贴壁后按上述步骤处理和备用细胞。每个实验组6个复孔。常规操作，在酶标仪492 nm处测定光密度（optical density，OD）值。

1.6 细胞总蛋白含量分析

各孔加入100 μL组织细胞裂解液，吸取裂解液至0.5 mL干净EP管中，12 000 r/min离心5 min，取上清；根据样品数量，BCA试剂A加BCA试剂B（50∶1）配制适量BCA工作液，充分混匀；PBS完全溶解蛋白标准品，取 10 μL稀释至 100 μL，使终浓度为 0.5 mg/mL；将标准品按 0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板的标准品孔中，PBS补足到20 μL；加入5 μL蛋白样品到96孔板的样品孔中，PBS补足到20 μL；各孔加入200 μL BCA工作液，37℃放置30 min；测定A570波长吸光值，根据吸光值和蛋白标准品计算出标准曲线，再根据标准曲线计算出各样品蛋白浓度。

1.7 细胞周期检测

将待测样本制成单细胞悬液，4℃预冷PBS洗涤1次；2 000 r/min离心5 min，收集并调整细胞浓度为1×106/mL；制备单细胞悬液用70%乙醇固定，4℃保存；取1 mL细胞悬液，加100 μL RNaseA 37℃孵育30 min；再加入300 μL PI混匀即可进行流式细胞分析。

1.8 细胞H2O2水平检测

空白管、标准管、测定管各加入1 mL试剂一（37℃预温），上述各管分别加入蒸馏水、H2O2标准品应用液（163 mmol/L）、待测样本均为 100 μL，混匀后37℃反应1 min，各管分别加入1 mL试剂二，混匀，于405 nm处测各管吸光度值。按照南京建成生物工程研究所提供的计算公式计算出H2O2的浓度。

1.9 细胞HOCL水平检测

细胞处理后，取培养上清70 μL，加入牛磺酸（40 mmol/L）25 μL，反应 5 min 后，加入 1 mmol/L 5，5′-二硫-2-酸硝基苯甲酸 （5，5′-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）5 μL 反应 5 min 后测定吸光度。在整个反应体系中，HOCL氧化牛磺酸生成牛磺酸氯胺，牛磺酸氯胺最后氧化DTNB生成5-硫-2-硝基苯甲酸 （5-thio-2-nitrobenzoic acid，TNB）。由于TNB在波长412 nm处有一特异性最大吸收峰，因此测定在A412处吸光度可以反映HOCL的水平。

2.0 统计方法

采用SPSS 13.0统计软件，所有检测指标均进行正态性检验，各计量资料数据以±s表示。经方差齐性检验，方差齐性时，两组间差异性比较采用t检验，方差不齐时用t′检验；多组间比较采用Oneway ANOVA和Student-Newman-Keuls多重比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 平滑肌细胞的鉴定

镜下见以平滑肌细胞为主的纤维样细胞呈梭形、长梭形或带状，核卵圆形居中。局部成束的细胞平行排列，部分区域细胞多层重叠，部分区域高低起伏呈“峰—谷”状生长。培养第5代细胞经特异的平滑肌肌动蛋白免疫细胞化学染色后，高倍镜下可见胞质内大量棕色、与细胞长轴平行的纤维细丝，即平滑肌α-肌动蛋白丝。核卵圆形居中，呈淡蓝色。见图1。

2.2 MTT试验结果

平滑肌细胞在AngⅡ以浓度1 μmol/L，即终浓度为100 nmol/L处理24 h后，与其他不同处理时间不同浓度比较（除外处理48 h的10 μmol/L浓度组）增殖明显（P＜0.05），见表1。

表1 细胞经不同浓度A n gⅡ处理后不同时间M T T的O D值（±s）T a b.1 O D v a l u e s o f M T T a f t e r t r e a t m e n t b y A n gⅡ a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s a n d t i m e p o i n t s（±s）O D v a l u e o f M T T 1 2 h 2 4 h 4 8 h 1 0 0 μ m o l/L g r o u p 0.2 5 4 0±0.0 1 9 8 0.4 3 4 2±0.0 2 0 6 0.4 5 5 6±0.0 3 1 2 1 0 μ m o l/L g r o u p 0.2 3 2 8±0.0 2 6 9 0.4 5 1 6±0.0 2 1 7 0.5 2 4 4±0.0 4 1 4 1 μ m o l/L g r o u p 0.2 3 9 2±0.0 3 4 4 0.5 2 3 4±0.0 0 7 4 1） 0.5 0 6 2±0.0 2 4 2 1 0 0 n m o l/L g r o u p 0.1 6 6 2±0.0 0 9 5 0.3 0 7 2±0.0 4 9 8 0.4 6 4 0±0.0 2 2 8 1 0 n m o l/L g r o u p 0.1 1 2 8±0.0 0 5 1 0.1 4 9 0±0.0 1 3 7 0.1 1 8 8±0.0 0 4 8 1）P ＜ 0.0 5 c o m p a r e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f t h e d i f f e r e n t p r o c e s s i n g t i m e s i n a d d i t i o n t o 1 0 μ m o l/L c o n c e n t r a t i o n a t 4 8 h.G r o u p

2.3 AngⅡ处理后对ROS影响

以AngⅡ终浓度100 nmol/L 24 h处理平滑肌细胞后，检测细胞ROS水平（OD值），结果显示，与正常对照组（23.17±1.5）比较，AngⅡ处理组（55.33±1.4）ROS显著增高（P＜0.05）。

2.3 NADPH氧化酶抑制剂、过氧化氢酶及ERK1/2抑制剂对AngⅡ诱导平滑肌细胞总蛋白合成的影响

以AngⅡ终浓度100 nmol/L 24 h处理平滑肌细胞后，检测细胞总蛋白，结果显示AngⅡ处理后总蛋白水平由处理前的（0.413±0.006）mg/mL升高至（0.619±0.042）mg/mL，说明AngⅡ处理后能明显增加平滑肌细胞DNA合成能力（P＜0.05），预先给予apocynin、catalase及PD98059与单用AngⅡ比较总蛋白合成分别下降至（0.471±0.008），（0.496±0.014），（0.448±0.013）mg/mL（P ＜ 0.05）。

2.4 NADPH氧化酶抑制剂、过氧化氢酶及ERK1/2抑制剂对AngⅡ诱导平滑肌细胞周期的影响

以AngⅡ终浓度100 nmol/L 24 h处理平滑肌细胞后，采用流式细胞术分析细胞周期进程情况。结果显示，与正常对照组比较，AngⅡ处理组细胞周期中 G1期降低，S期明显增高（P＜ 0.05），说明 AngⅡ具有明显诱导血管平滑肌细胞分裂、增殖的作用；预先给予 apocynin、catalase及 PD98059处理后，G1期增加，S期降低，说明这3种药物可抑制AngⅡ的促细胞增殖效应（P ＜ 0.05），见表 2，图 2。

表2 药物干预对血管平滑肌细胞细胞周期进程的影响（±s）Tab.2 Ef f ecton VSM C cycl e progressi on w i t h AngⅡt reat m entat di f f erentconcent rat i ons（±s）Group G1 S Control 58.02±0.29 37.40±0.72 AngⅡ 49.37±1.231） 45.62±0.351）AngⅡ+apocynin 55.93±0.472） 41.84±0.452）AngⅡ+catalase 54.19±1.072） 43.04±0.312）AngⅡ+PD98059 57.59±0.082） 40.89±0.282）1）P<0.05 vs control group；2）P<0.05 vs AngⅡgroup.

2.5 NADPH氧化酶抑制剂、过氧化氢酶及ERK1/2抑制剂对AngⅡ诱导平滑肌细胞增殖时H2O2、HOCL的影响

以AngⅡ终浓度100 nmol/L 24 h处理平滑肌细胞后，采用比色法检测H2O2、HOCL水平，结果显示在 AngⅡ处理组 H2O2水平［（1.223±0.255）mmol/L］显著高于对照组［0.362±0.032）mmol/L］（P ＜ 0.05），预先给予apocynin、catalase与单用AngⅡ比较H2O2水平分别为（0.680±0.020）mmol/L、（0.315±0.034）mmol/L（P ＜ 0.05）；而 PD98059 为（1.040±0.161）mmol/L，对AngⅡ诱导H2O2生成无明显影响（P＞0.05）。

在AngⅡ处理组HOCL OD值为0.101±0.003，显著高于对照组（0.038±0.004，P ＜ 0.05），预先给予apocynin、catalase与单用AngⅡ比较HOCL OD值分别降至 0.078±0.001、0.036±0.010，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；而 PD98059（0.092±0.004）对 AngⅡ诱导的HOCL生成无明显影响（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 AngⅡ诱导VSMC增殖

本实验结果显示，AngⅡ处理后可促使VSMC增殖，同时伴有ROS增高，说明在AngⅡ诱导的细胞增殖过程中，ROS可能参与其中。适量ROS是维持细胞生长和机体抗感染所必需的，但过量ROS可对机体造成病理生理损害［6］。本实验中AngⅡ处理组较正常组ROS水平增高。ROS是调节VSMC增殖、肥大和迁移的重要信号分子［7］。在我们之前的动物实验中，已证实PVAT可产生AngⅡ，并与高血压血管重构相关［8］。近年来，ROS被证明为细胞内信号分子，诱导细胞的增殖［9，10］。因此推断在 PVAT AngⅡ诱导高血压血管重构的机制中ROS作为信号分子参与其中。ROS可激活特异性的信号传导途径、协调病理生理反应、打开细胞内信号的级联反应，影响血管重构时细胞进程［11］。

3.2 ROS介导AngⅡ诱导VSMC增殖的机制

在AngⅡ诱导VSMC增殖的过程中，何种ROS在激活氧化还原信号途径中起主要作用尚不清楚。大多数 ROS（如 O2-、OH-、ONOO-等）性质高度活泼，极不稳定。相对而言，H2O2比较稳定，且容易在细胞内和细胞间扩散，因此H2O2极可能是启动氧化还原信号途径的分子。在本实验中，AngⅡ处理后在明显诱导VSMC增生的同时，H2O2水平也随着明显升高，在给予 apocynin及 catalase后，AngⅡ诱导VSMC的增殖能力下降，并且H2O2水平亦显著下降，提示H2O2为AngⅡ效应分子，且为 VADPH氧化酶（Nox）源性。这与很多研究中认为H2O2作为主要效应分子介导AngⅡ诱导的平滑肌细胞增殖以及血管重构的结果一致［12～14］。当H2O2在细胞内大量堆积时，可能会激活细胞内氧化还原信号多条途径，生成大量HOCL等化学物质。本实验中，AngⅡ在诱导VSMC增殖的同时，同样亦有HOCL的明显升高，在预先给予apocynin及catalase后，这两种效应同时降低，提示HOCL参与了AngⅡ诱导VSMC增殖的过程。研究报道，HOCL能促使ERK1/2磷酸化而诱导血管VSMC迁移，从而在血管重构中起着重要作用，而抗氧化剂和ERK1/2抑制剂能逆转该效应［15］。本实验发现，在给予apocynin及catalase后，AngⅡ诱导细胞增殖能力下降的同时，H2O2及HOCL水平亦下降，而PD98059虽能抑制细胞增殖，却未能降低H2O2及HOCL的水平，提示AngⅡ诱导VSMC增殖过程中的机制涉及Nox/H2O2/HOCL/ERK1/2途径。

综上所述，ROS在介导AngⅡ诱导VSMC增殖的过程中起着重要作用。以NADPH氧化酶源的H2O2为底物生成HOCL，从而激活ERK1/2，促进血管平滑肌细胞增殖，这为PVAT与血管重构的相关性研究提供了依据。

［1］Yang Y，Parsons KK，Chi L，et al.Glutathione S-transferase-microl regulates vascular smooth muscle cell proliferation，migration，and oxidative stress［J］.Hypertension，2009，54（6）：1360-1368.

［2］Briones AM，Rodriguez-Criado N，Hernanz R，et al.Atorvastatin prevents angiotensinⅡ-induced vascular remodeling and oxidative stress［J］.Hypertension，2009，54（1）：142-149.

［3］Rhian MT.Reactive oxygen spercies in vascular biology：role in arterial hypertension［J］.Expert Rev Cardiovasc Ther，2003，1（1）：91-106.

［4］Lee MY，Griendling KK.Redox signaling，vascular function，and hypertension［J］.Antioxid Redox Signal，2008，10（6）：1045-1059.

［5］Gao YJ.Dual modulation of vascular function by perivascular adipose tissue and its potential correlation with adiposity/lipoatrophy-related vascular dysfunction ［J］.Current Pharmaceutical Design，2007，13（21）：2185-2192.

［6］李卫萍，孙明，贾三庆.阿托伐他汀对自发性高血压大鼠主动脉活性氧、p22phox表达和SOD活性的影响［J］.首都医科大学学报，2005，26（2）：116-119.

［7］Taniyama Y，Griendling KK.Reactive oxygen species in the vasculature：molecular and cellular mechanisms［J］.Hypertension，2003，42（6）：1075-1081.

［8］史吉莹，刘唐威，黄荣杰，等.血管周围脂肪组织在肾性高血压血管重构中的作用［J］.广西医科大学学报，2012，29（2）：189-192.

［9］Thannickal VJ，Fanburg BL.Reactive oxygen species in cell signaling［J］.Am J Physiol：Lung Cell Mol Physiol，2000，279（6）：L1005-1028.

［10］邹彤，刘楠，李树德，等.维生素E抑制同型半胱氨酸介导的血管平滑肌细胞增殖［J］.南方医科大学学报，2007，27（6）：783-786.

［11］魏万林，刘文，张薇，等.氧化应激与血管重构［J］.实用老年医学，2008，22（1）：66-69.

［12］Lee MY，San Martin A，Mehta PK，et al.Mechanisms of vascular smooth muscle NADPH oxidase 1（Nox1）contribution to injury-induced neointimal formation ［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29（4）：480-487.

［13］Zafari AM，Ushio-Fukai M，Akers M，et al.Role of NADH/NADPH oxidase-derived H2O2in angiotensin Ⅱ-induced vascular hypertrophy［J］.Hypertension，1998，32（2）：488-495.

［14］Kim J，Min G，Bae YS，et al.Phospholipase D is involved in oxidative stress-induced migration of vascular smooth muscle cells via tyrosine phosphorylation and protein kinase C［J］.ExpMolMed，2004，36（2）：103-109.

［15］Zhang F，Hu Y，Xu Q，et al.Different effects of angiotensin II and angiotensin-（1-7）on vascular smooth muscle cell proliferation and migration［J］.PloS One，2010，5（8）：e12323.