Th9细胞在兔骨髓炎局部组织中的表达

程明国 沈若武 王守彪 夏玉军

1.青岛大学医学院人体解剖学教研室，山东青岛 266041；2.青岛市第三人民医院骨外科，山东青岛 266041

骨髓炎是一组细菌感染骨髓、骨皮质和骨膜而引起的炎性疾病。机体免疫状态对骨髓炎的发生发展影响很大，一些研究证实骨髓炎时出现T和B淋巴细胞功能的障碍[1-2]，而关于其免疫调节状态还有许多不明之处。近年来研究发现，机体内存在着一群新型的不同于已知的Th17、Th1、Th2和Treg的CD4+Th细胞亚群，具有分泌IL-9和IL-10的能力，称之为Th9细胞[3-4]。目前，尚未见Th9细胞与骨髓炎有关的报道。本文旨在通过研究骨髓炎患者局部组织中Th9细胞效应因子IL-9、IL-10的含量，探讨Th9细胞在骨髓炎发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

大耳白兔20只，体重2.2～2.5 kg，雌雄不限，购于山东鲁抗医药公司动物中心（许可证号scxk鲁20080011）。将动物随机分为手术组（n=10），假手术组（n=5）和对照组（n=5）。

1.2 主要试剂

IL-9和IL-10单克隆抗体（兔抗鼠），即用型SABC试剂盒等，购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 建立兔胫骨近端骨髓炎模型

10%水合氯醛（500 mg/kg）腹腔注射麻醉，取仰卧位，无菌条件下取右胫骨髌内下纵切口，长约4 cm。切开皮肤、皮下，显露胫骨近端内侧，用3 mm钻头的手钻，在该处钻3个纵向相连、部分重叠的骨洞。用小刮匙刮除松质骨，修整骨洞边缘，制成一1.0 cm×0.5 cm的矩形骨窗。于骨窗内注入5×106CFU/mL金葡球菌0.5 mL及鱼肝油酸钠50 g/L 0.5 mL，10 min后用骨蜡将骨窗封闭，反复冲洗后缝合伤口[5]，术后回笼常规喂养2周后处死。假手术组仅显露胫骨，然后关闭切口。正常对照组不做任何处理。

1.4 HE染色及免疫组织化学染色观察

术后2周腹腔注射麻醉后，在无菌条件下切取兔右胫骨近端骨窗上下约2 cm，纵行剖成两半后用4%多聚甲醛固定24 h、20%EDTA脱钙脱钙、浸蜡包埋、连续切片。应用免疫组织化学SABC三步法染色，检测IL-9、IL-10的表达，DAB显色，镜下控制显色时间。最后脱水，透明，封片，显微镜观察。

1.5 免疫组化染色结果分析

细胞浆内黄褐色或棕褐色颗粒即为免疫组化染色阳性结果。利用德国Sample PCI图象分析系统对免疫组化染色结果进行光吸收密度测量分析，将免疫组化染色结果转化为光吸收密度值进行定量分析。每张切片测定5个视野取平均吸光度值，以其作为切片的测定值。

1.6 统计学处理

采用SPSS 11.0统计分析软件进行分析处理。数据以均数±标准差（±s）表示。两组间比较应用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果

正常对照组及假手术组骨组织内只有少量中性粒细胞、T淋巴细胞及巨噬细胞等浸润，炎症反应不明显，无坏死区域。手术组骨组织内可见大量的中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的聚集，骨质呈灶性坏死及片状坏死区，并可见纤维结缔组织增生。

2.2 IL-9、IL-10的免疫组化染色结果

正常对照组及假手术组骨组织内IL-9、IL-10阳性表达较弱，而手术组则呈强阳性表达，淋巴细胞浆内可见黄褐色或棕褐色颗粒，差异有统计学意义（P<0.05）；结果见表1。

表1 各组局部骨组织内IL-9、IL-10的免疫组化染色的平均光密度值（±s）

表1 各组局部骨组织内IL-9、IL-10的免疫组化染色的平均光密度值（±s）

注：与正常组、假手术组比较，#P<0.05

组别 例数（n） IL-9 IL-10正常组假手术组手术组5 5 1 0 0.221±0.011 0.315±0.013 1.024±0.313#0.219±0.031 0.268±0.043 1.356±0.487#

3 讨论

骨髓炎是目前骨科临床上较常见的难治性疾病。目前，对骨髓炎的治疗措施主要有加强全身营养及大量应用抗生素，置管冲洗，适时采用彻底清创取出死骨，局部肌瓣填塞等。然而这些方法都难以取得满意的疗效，许多学者认为，改善局部血供和充分发挥机体在局部的免疫功能可能是解决问题的关键[6]。机体的抗细菌感染免疫主要依靠T、B淋巴细胞及相关辅助细胞发挥的适应性免疫，所以有关骨髓炎的免疫调节日益受到重视。

Th9细胞由TGF-β和IL-4诱导，其不同于已知的Th1、Th17、Th2和Treg，是一种能分泌IL-9、IL-10的新型的CD4+效应T细胞亚群[7]。Th9细胞发挥免疫调节作用的主要效应因子是IL-9，它通过与各类效应性T细胞或其他细胞因子的相互作用发挥免疫调节功能。IL-9可作用于不同的炎症细胞，如T、B淋巴细胞、肥大细胞、中性粒细胞，使得炎症细胞的数量增加并分泌一些炎症介质，促进炎症的发生[8]。此外，IL-9还可作用于组织细胞，在许多疾病的发生发展中起关键作用[9]。本文研究显示：骨髓炎的局部骨组织中IL-9的表达明显高于正常组，说明IL-9在骨髓炎疾病改变中起到重要的炎性介质作用，加速了炎症病变的进展速度，这与目前IL-9在其他组织器官的慢性炎症中的研究结果相似。

Th9细胞除了IL-9这个效应因子外，还分泌IL-10。IL-10是一种有效的抗炎因子，在病原微生物的感染中发挥着免疫调节作用，一直以来作为抗炎因子被广泛关注。IL-10还可由B细胞、单核/巨噬细胞、角化细胞和肿瘤细胞及人Th2细胞分泌产生，并能够抑制炎性反应，限制炎症的发展[10]。本文研究显示骨髓炎的局部骨组织中IL-9的表达明显高于正常组，这与其他学者的研究结果相似[11-12]。IL-10在骨髓炎的局部骨组织中的高表达，可能是因为机体对维持促炎性细胞因子与抑炎性细胞因子之间的平衡做出的自身调节。促炎性细胞因子与抑炎性细胞因子之间的平衡是维持正常免疫状态的基础，这也说明骨髓炎局部组织中存在着抑制促炎性细胞因子的过高表达。

综上所述，笔者认为Th9细胞在骨髓炎发病中起到了重要的免疫调节作用，虽然IL-10在骨髓炎的局部骨组织中高表达，但IL-9才是Th9细胞发挥免疫调节作用的主要效应因子，所以笔者认为Th9细胞在骨髓炎发病中起到了促进炎症发生的作用。

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