禽白血病病毒群特异性抗原单克隆抗体的制备与鉴定

炳岭，李德龙，胡晓亮，刘在斯，秦立廷，吴 关，刘 文，祁小乐，王永强，高宏雷，高玉龙*，王笑梅*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001；2.黑龙江出入境检验检疫局，黑龙江哈尔滨150090)

禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)属反转录病毒科，禽C性反转录病毒属，可以引起禽类多种肿瘤性疾病。该病在世界各地均有发生，感染率高，发病率低，是危害养禽业的主要疾病之一[1]。目前，该病尚无彻底可行的防制措施，迄今为止尚无有效地疫苗，而预防该病的主要方法是培育具有遗传性抵抗力的新品种，淘汰阳性鸡，净化种群，经过几代选育出无白血病的鸡群[2]。自2008年以来，蛋鸡感染J亚群白血病病毒在国内广泛流行，并引起产蛋量下降[3-6]。自1868年，Roloff报道禽白血病以来，研究人员在病毒的分离、鉴定、检测和诊断方面取得了一定的成就，建立了大量的检测方法，如病毒中和试验、琼脂扩散实验、补体结合试验、ELISA、放射免疫、免疫荧光技术等[7-8]。ALV的主要蛋白质组分为gag基因编码的核心蛋白、pol基因编码的3种酶、env基因编码的2种糖蛋白。在gag编码的非糖基化蛋白中，p27是主要的群特异性抗原，是一种高度保守的非糖基化蛋白，有许多病毒抗原位点，是制备检测抗体的首选抗原。本实验制备针对p27的单克隆抗体(MAb)，有助于ALV感染的检测和病情监测。

1 材料和方法

1.1 病毒株、细胞和血清 ALV-J(HB09JY03)、ALV-A和ALV-B由哈尔滨兽医研究所分离鉴定；DF-1、S/P20细胞由本实验室保存；兔抗天然p27蛋白阳性血清由本实验室制备。

1.2 菌株及主要试剂 克隆载体pMD18-T、原核表达载体pET-30a、大肠杆菌DH5α和BL21由本实验室保存；DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收提取试剂盒购自AXYGEN公司；T4DNA连接酶、IPTG、pMD18-T载体等购自宝生物工程(大连)有限公司；HPR标记的羊抗鼠IgG、抗鼠荧光二抗、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒购自Southern Biotech公司；1640培养基、HAT、HT购自GibcoBRL；蛋白纯化用填充材料购自GE healthcare。

1.3 引物的设计与合成 根据ALV-J株的序列[9]，采用软件Primer prem ier 5.0设计一对引物p1、p2用于扩增p27基因，上游引物P1：5'-CGGGATCCATG CCTGTAGTGATTAAGAC-3'，含有 Bam HⅠ酶切位点。下游引物P2：5'-ACGTCGACCTAGGGCTGGAT AGCAGACG-3'，含有SalⅠ酶切位点。

1.4 DNA提取和p27基因的扩增 将ALV-J接种于对数生长期的DF-1细胞，7d后收集并冻融3次。采用DNA提取试剂盒从DF-1细胞冻融液中提取DNA。并以其为模板进行PCR扩增，反应条件为：94℃ 5m in；94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 1min，35个循环，72℃10m in。扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.5 重组表达载体的构建及鉴定 利用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接于pMD-18T载体后转化，提取重组质粒，Bam HⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，阳性重组质粒命名为pMD-p27并测序。利用Bam HⅠ和SalⅠ双酶切质粒 pMD-p27和 pET-30a，分别回收720bp和4900bp片段，T4DNA连接酶连接，产物转化BL21感受态细菌，小量提取质粒，Bam HⅠ和SalⅠ双酶切鉴定出阳性重组质粒，命名为pET-p27。

1.6 p27蛋白的表达、纯化及活性检测 挑取单个含有pET-p27的BL-21细菌菌落加入含Kna(100μg/m L)的LB中，37℃过夜振摇培养，次日扩大培养至OD600nm值约为0.8，加入IPTG至终浓度0.1mM，于37℃诱导6h，收获细菌。离心后，将菌体用PBS重悬(50μL PBS/m L LB)，于4℃过夜后，超声波裂解菌体，离心取上清，SDS-PAGE电泳分析。按照文献[10]方法进行纯化，将纯化的p27蛋白用兔抗天然p27蛋白阳性血清进行western blot分析。

1.7 动物免疫 向纯化的p27蛋白(2mg/m L)中加入等量的弗氏完全佐剂，乳化后皮下注射7周龄BLAB/c小鼠，每只0.05m L；21d后用含等量弗氏不完全佐剂的p27蛋白腹腔注射二次免疫，0.1m L/只，21d后仅用p27蛋白腹腔兼尾静脉注射(0.05m L/只)加强免疫，3d后取脾脏用于融合。

1.8 阳性杂交瘤细胞株的建立 取免疫鼠脾脏制成细胞悬液与处于对数生长期的S/P20细胞以8∶1的比例融合。待融合细胞长至孔底1/2或1/3时，通过间接ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞株，再利用有限稀释法连续克隆2次～3次。至阳性率为100%后进行扩大培养，冻存于液氮中。

1.9 p27MAb的制备 将筛选得到的杂交瘤细胞进行扩大培养后，以5×106/0.5m L杂交瘤细胞腹腔注射BLAB/C小鼠1m L，14d后待小鼠腹围增大后收集腹水，1000r/min离心10min，上清以0.45μm滤器过滤后即为腹水MAb粗制品。

1.10 MAb的效价测定及亚类的测定 将纯化的p27蛋白作1∶1000稀释包被酶联反应板，采用间接ELISA方法测定腹水中MAb效价，以P/N>2.5的最大稀释度作为抗体的效价。采用免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒检测5株p27MAb的亚类。操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.11 特异性鉴定

1.11.1交叉反应鉴定将ALV-J、ALV-A、ALV-B、IBV、MDV、AIV H5、AIV H7、AIV H9、ILTV、FPV、IBDV、NDV、ARV和REV 14种病毒根据蛋白含量的不同，稀释至约15μg/m L，包被酶联反应板，间接ELISA检测其与MAb的反应，以DF-1细胞冻融离心后上清液作为阴性对照，PBS作为空白对照。OD450nm>0.2判定为阳性。

1.11.2间接荧光免疫反应鉴定将ALV-J(HB09JY03)、ALV-A和ALV-B接种于含DF-1细胞的24孔细胞板，将未接种病毒的DF-1作为阴性对照。5d后无水乙醇固定 15m in，并将 MAb 2E5、3H8、4B7、6D9和10G2做1∶200稀释，加入细胞板孔内，室温孵育1h。PBST洗4次，抗鼠荧光二抗做1∶200稀释避光室温孵育1h，洗板后加入PBS，荧光显微镜观察结果。

2 结果

2.1 重组质粒pET-p27的鉴定 将pET-p27以Bam HⅠ和SalⅠ双酶切，所得片段与预期相符，p27基因全长720bp，编码239个氨基酸残基。

2.2 p27蛋白的表达、纯化及活性检测 将表达蛋白在非变性条件下纯化获得His-p27融合蛋白，分子量约为34ku(图1A)，经SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，用兔抗天然p27蛋白阳性血清进行western blot分析，结果所表达的蛋白具有生物反应活性(图1B)。

2.3 阳性杂交瘤株的建立 细胞融合率为89.4%，最终筛选出5株持续分泌抗ALV p27蛋白的MAb杂交瘤细胞株，编号分别是2E5、3H8、4B7、6D9和10G2。

2.4 MAb效价及亚类的测定 采用已建立的ELISA方法对 2E5、3H8、4B7、6D9和10G2进行效价测定，结果分别为：27、210、29、27和28。免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒测定5株MAb的结果显示：2E5为IgG2b；3H8、4B7、6D9和10G2均为IgG1。

图1 诱导表达p27蛋白的SDS-PAGE和western blot分析Fig.1SDS-PAGE(A)and western blot(B)analyse of p27protein

2.5 特异性鉴定 采用不同病毒对MAb进行ELISA检测，结果显示IBV、MDV、AIV H5、AIV H7、AIV H9、ILTV、FPV、IBDV、NDV、ARV和REV与5株MAb反应的OD450nm值均小于0.15，并且 ALV-J、ALV-A、ALV-B与 5株 MAb反应的OD450nm值均大于1.2。表明5株MAb有良好的特异性(图 2)。分析荧光显微镜观察 MAb 2E5、3H8、4B7、6D9和 10G2分 别 与 ALV-J(HB09JY03)、ALV-A和ALV-B呈阳性反应，呈现明显的绿色荧光，而阴性对照无绿色荧光(图3)。

图2 特异性鉴定Fig.2Identification of the specificity of p27MAb

3 讨论

图3 MAb间接荧光免疫反应分析结果Fig.3IFA analysis for p27monoclonal antibody

禽白血病主要危害有两个方面，一是产生肿瘤，导致鸡死亡；二是引起母鸡产蛋率下降、蛋重减轻等生产指标的改变；另外还能够引起鸡的免疫抑制，继发其他细菌和病毒的感染，造成严重的经济损失。1997年和1998年，J亚群禽白血病在世界范围内爆发，给养禽业造成了严重的经济损失[11]。近些年来，在国内许多省份，ALV-J主要感染15周～29周龄蛋鸡，引起产蛋量显著下降，趾骨周围皮肤和羽毛处淋巴结出血[6]。

本实验将ALV p27在BL21E.coli中表达，原核表达系统相对于真核表达系统具有成本低、操作简便、表达量高等优点，并且省去了传统方法通过提纯病毒、去污剂裂解、电泳提纯目的蛋白的繁琐步骤[12-13]。其表达载体pET-30a是一种高效的融合HIS标签的原核表达系统，经过诱导表达的融合蛋白，采用亲和层析法纯化，从而获得高纯度的目的蛋白，为下一步特异性MAb的获得奠定了基础。

在p27MAb制备过程中，本研究采用原核表达的p27蛋白作为免疫原，经过细胞融合、筛选及克隆化，最终制备了5株针对p27的MAb。其效价高达107以上，并且分泌抗体稳定、特异性高。5株MAb与常见的外源性ALV-J、ALV-A、ALV-B[14]反应特异，能够观察到明显的荧光，而与DF-1不反应，为禽白血病的诊断、防控和净化奠定了基础。

本研究为p27蛋白抗原决定簇的研究和ALV在病原学、血清学、组织化学和基因表达等方面的研究提供了有力工具；为禽白血病ELISA抗原诊断试剂盒研制奠定了基础。

[1]B W.卡尔尼克(高福，等译).禽病学[M].第10版，北京：中国农业大学出版社，1999.

[2]陈晨，曹红，陈富勇，等.抗禽白血病p27抗原单克隆抗体的制备与鉴定[J].中国预防兽医学报，2005，4：287-289.

[3]Shi M in,Tian M ing-xing,Liu Cheng,et al.Sequence analysis for the complete proviral genome of subgroup J avian leukosis virus associated w ith hemangioma:a special 11bp deletion was observed in U3region of 3'UTR[J].Virol J,2011,8:158.

[4]Lai Hai-zhang,Zhang He-nan,Ning Zhang-yong,et al.Isolation and characterization of emerging subgroup J avian leukosis virus associated w ith hemangioma in egg-type chickens[J].Vet M icrobiol,2011,3:1-9.

[5]Wu Xiao-ping,Qian Kun,Qin Ai-jian,et al.Recombinant avian leukosis viruses of subgroup J isolated from field infected commercial layer chickens w ith hemangioma and myeloid leukosis possess an insertion in the E element[J].Vet Res Commun,2010,34:619-632.

[6]Gao Yu-long,Qin Li-tin,Pan Wei,et al.Subgroup J avian leukosis virus in layer flocks in China[J].Emerging Infect Dis,2010,16:1637-1638.

[7]李国有，应用ELISA和琼扩试验对比检测鸡白血病病毒群特异性抗原[J].中国畜禽传染病，1987，1：17-18.

[8]Saunder G C.Application of the indirect enzyme-labeled antibody m icrotest to the detection and surveillance of animal diseases[J].J Infect Dis,1977,136:258-266.

[9]潘伟，高玉龙，秦立廷，等.蛋鸡J亚群禽白血病病毒株HB09JY03的分离鉴定及全基因组序列分析[A].中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C].2010：39-41.

[10]汪家政.蛋白质技术手册[M].北京：科学出版社，2001.

[11]Johns on E S.Poultry oncogenic retroviruses and humans[J].Cancer Detect Prev,1994,18:9-30.

[12]M izuno Y,Itohara S.Enzyme-linked immunosorbent assay to detect subgroup-specific antibodies to avian leukosis viruses[J].Acta Virol,1986,30(2):81-103.

[13]蔡雪晖，何兆忠，周文举.禽白血病/肉瘤群病毒群特异性抗原P27gag的分离和纯化[J].中国畜禽传染病，1995，1(80)：448-511.

[14]Calnek B.Lymphoid leukosis virus:a survey of commercial breeding flocks for genetic resistance and incidence of embryo infection[J].Avian Dis,1968,12:104-111.