广东珠三角地区犬细小病毒分离与鉴定

黄永亮，施赫赫，冯顺意，王怡飞，米政实，刘慧思，徐晓娟，张 莹，吴晓薇,2，牛学锋,3，郭霄峰*

(1.华南农业大学兽医学院，广东广州510642；2.广东省出入境检验检疫技术中心， 广东广州510642；3.Department of Veterinary Pathology,Athens,GA 30602)

犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)是细小病毒科(Parvoviridate)细小病毒属(Parvovirus)的成员，为单股无囊膜的DNA病毒，基因组全长约5.0kb[1]。1978年美国学者Eugster和Nairn首次从患有肠炎的病犬体内分离获得CPV，其后，加拿大、澳大利亚、法国、日本等国均有该病发生的报道。患病犬以呕吐、出血性肠炎及白细胞减少为主要特征，幼犬对CPV的易感性高，可以引起幼犬的心肌炎，因此CPV的感染对养犬业和经济动物养殖业危害很大[2-3]。CPV不断通过抗原漂移产生新的突变株，宿主范围不断扩大。先前的CPV-2株已发展为CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c(a)和 CPV-2c(b)4个不同的亚型[4-6]。我国流行株主要以CPV-2a为主，南方地区CPV-2b也有流行。

CPV疫苗对该病的控制起到了积极的作用，但疫苗的使用导致的抗原漂移产生新突变株，疫情控制仍然不理想，主要流行株有待进一步分析。本研究通过在广州及深圳地区各大动物医院采集疑似CPV感染犬只的粪便，接种于F81细胞分离病原并结合PCR检测、血凝试验及动物试验等验证分离株。实验结果表明所分离的19个病毒株均为CPV。

1 材料和方法

1.1 病料、实验动物、细胞 疑似CPV感染犬的粪便样品采自广州和深圳各宠物医院；2月龄比格犬购自广州医药工业研究所增城比格犬场；F81细胞为本实验室保存。

1.2 主要试剂及引物 2×PCR M ix购自北京全式金生物技术有限公司；DL2000DNA Marker购自天根生化科技(北京)有限公司；细胞培养材料购自GIBCO公司；检测引物参考文献[7]的序列检测CPV VP2基因保守区域的引物P1和P2，预期扩增片段为 585bp，P1：5'-TGTAAGCTTCCAGGAGAC T-3'；P2：5'-ATAACCTGGAGGCACAAGT-'3，由上海捷瑞生物工程技术有限公司合成。

1.3 CPV DNA的提取 采用常规的苯酚/氯仿方法提取CPV的DNA。

1.4 CPV的PCR检测 PCR反应体系：12.5μL 2×PCR M ix、1μL P1、1μL P2、2μL模板 DNA、ddH2O补至25μL。PCR反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s、45℃ 30s、72℃ 45s，共30个循环；72℃10m in。PCR产物由上海英俊生物科技有限公司测序，再在NCBI上进行在线Blast分析。

1.5 病原分离 病料以PBS制成1∶8悬液，混匀后离心取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，接种于F81细胞，37℃、5%CO2的培养箱中培养，同时设正常细胞对照。每天观察细胞贴壁生长情况和细胞病变(CPE)。待出现80%病变(约4d)时收毒。

1.6 病毒核苷酸同源性分析与进化树绘制 从GenBank下载CPV VP2基因序列与本研究中VP2基因在DNAStar进行序列比对并绘制进化树。

1.7 血凝试验(HA)与组织半数感染量(TCID50)分析取疑似CPV样品处理液以及第5代细胞培养物采用1%猪红细胞进行HA试验。将CPV的第5代细胞培养物作10倍倍比稀释，取10-7、10-6、10-5和10-44个稀释度分别接种于6瓶F81细胞悬液内，每瓶1m L。于37℃培养96h，观察CPE，按Reed-Muench法计算TCID50。

1.8 动物回归试验 将4只试验用比格幼犬随机分2组，随机选择HA效价达28并且为CPV-2a亚型病毒株，在攻毒组分别由皮下注射3m L和口服7m L CPV-s5细胞培养病毒液；对照组分别皮下注射及口服相应剂量的生理盐水。各组分开饲养，每天观察临床表现，记录各种变化。

2 结 果

2.1 PCR检测结果与测序分析 利用特异性引物对病犬的粪便样品进行PCR扩增，得到(19/32)与预期片段(585bp)相符的目的条带(图1)。PCR产物核苷酸测序结果表明，所得病毒序列为CPV序列。对测定的VP2基因部分序列进行BLAST比对，绘制进化树，结果显示，相互之间的同源性达97%～99.5%，其中CPV-s5与北京株(EF666062、EF666067、EU145955)具有较高的同源性，CPV-s8和CPV-s10则与杭州株(EU213081)、深圳株(EU170352)有较高的同源性，CPV-s2和CPV-g13与北京株(EU145959)有较高的同源性，CPV-s6、CPV-g5和CPV-g11与泰国株(GQ379042、GQ379045、GQ379048)具有较高的同源性，CPV-g15与杭州株(EU213078、长春株(GU380303)具有较高的同源性，CPV-g4、CPV-g6、CPV-g7和CPV-g12与杭州株(EU483516)具有较高的同源性，而CPV-g1则与山东株(GQ857605、GQ857608)具有较高的同源性(图 2)。CPV-2与CPV-2a在VP2蛋白有5个氨基酸发生了突变(Met-87突变为Leu、Ile-101突变为Thr、Ala-300突变为 Gly、Asp-305突变为 Tyr和 Val-555突变为Ile)；CPV-2a与CPV-2b的区别主要有两个氨基酸位点(Asn-426突变为 Asp和 Ile-426突变为 Val)；而CPV-2c与CPV-2b的区别主要在426位氨基酸(Glu-426突变为Asp)[8]。由推导氨基酸序列显示，所分离的19份阳性样品中，16份为CPV-2a亚型(CPV-g4、 CPV-g5、 CPV-g6、 CPV-g7、 CPV-g11、CPV-g12、 CPV-g13、 CPV-s2、 CPV-s3、 CPV-s4、CPV-s5、 CPV-s6、 CPV-s7、 CPV-s8、 CPV-s9、CPV-s10)，1份为CPV-2b亚型(CPV-1130)，2份为CPV-2c 亚型(CPV-g1、CPV-g15)。

图1 PCR检测结果Fig.1Results of PCR

图2 VP2基因同源性进化树Fig.2Phylogenetic tree of VP2genes of CPV

2.2 病毒分离与培养 第3代病毒在F81细胞中培养96h左右开始出现肿胀、圆缩、凝聚成团或絮状脱落，并在细胞核内形成圆形和椭圆形嗜酸性、大小不等的包涵体。

2.3 血凝效价与TCID50的检测 检测的样品处理液中，19份样品血凝价为1∶256、12份样品为阴性。在第5代细胞培养液中，除CPV-1130为阴性，其余分离株均达到1∶256。

病毒培养至第5代，在F81细胞中测定各病毒株的TCID50，结果显示，所有病毒株均在10-6左右(表 1)。

表1 病毒HA效价与TCID50(/0.1m L)Table 1HA titer and TCID50(/0.1m L)of CPV

2.4 动物试验 以CPV-S5的培养物分别口服和皮下接种CPV阴性的比格犬，攻毒后2d即发现犬只血便、食欲减退、呕吐、发热、被毛凌乱无光泽，第5d死亡。剖检可见肠管壁有大量的出血点，肠粘膜出血；胃粘膜破损、有出血点；脾脏表面粗糙、干燥、无弹性，有大量淤血坏死灶；肝脏有大量的出血点及淤血坏死灶。取粪便做PCR检测，结果呈阳性；血凝效价为27。从以上的特征性临床症状、病理解剖及实验室诊断结果表明该回归试验成功，试验犬为CPV感染致死。

3 讨 论

CPV可在MDCK、BHK21、Vero、F81等多种传代细胞中进行增殖，但只在F81细胞中增殖时导致细胞圆缩、脱落等明显的病变[9]。本研究曾在MDCK、BHK21、Vero、BHK-21细胞进行分离，MDCK细胞中虽有病变，但CPE不明显，效果不理想，而F81细胞分离可见明显CPE，与之前的研究结果一致[10]。原因可能是因为不同细胞系的表面受体不一致，抗损伤能力不同以及CPV对不同细胞系的敏感性不同造成的。CPV的DNA复制发生在细胞核内，其复制过程出现于细胞周期的S期，完全依赖宿主DNA聚合酶及其复制体系进行复制。因此，该病毒的接种最好采用同步接种方式。本研究将分离株同步接种F81，CPE出现较规律，即接毒后4d细胞开始圆缩、凝集成团或絮状脱落。

CPV有较强的血凝特性，能够凝集猪和恒河猴的红细胞。也有文献报道，CPV也可以凝集猫、马和仓鼠的红细胞。国外有报道应用硼酸缓冲液处理CPV，也能凝集犬和绵羊的红细胞，但不能凝集牛、山羊、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、地鼠、鸡、鹅和人的O型红细胞。HA-HI于1980年正式用于CPV的检测。虽然该方法简单、敏感、可靠、经济，可以迅速检出粪便提取物或细胞培养物中的CPV抗体，但结果不稳定，特别是对感染后期检测的准确率较低。为检出后期粪便中出现的IgM等抗体，以及被此种抗体凝集失去血凝活性的CPV抗原，可以采用2-巯基乙醇对检测的样品进行处理，提高阳性检出率。通过对HA-HI试验条件进行全面优化，可大大地提高阳性检出率与准确率[11]。本研究曾以传统方法进行检测，但检出率较低；运用改良后的方法，获得了较为稳定的、可靠的实验结果。

一般认为，CPV是FPV或FPV样病毒通过基因突变而产生。自20世纪70年代末在美国分离到CPV，之后迅速呈现全球流行分布，为了与之前发现的犬细小病毒-犬极小病毒区分，命名为CPV-2[12]。我国于1983年正式报道了该病的流行。从CPV的报道来看，1979年～1985年间以传统的CPV-2亚型为主，随后被CPV-2a亚型替代，继而CPV-2a亚型发生点突变又出现了新的亚型CPV-2b，很快在全球范围内流行，形成CPV-2a和CPV-2b共存的流行分布。2000年后，意大利、德国、西班牙、英国、越南和南美洲等出现新的流行亚型CPV-2c[13]，2010年有报道我国出现CPV-2c亚型病毒株[14]。我们的调查研究显示，CPV-2a基因亚型依然是珠三角地区主要流行亚型(其中，深圳分离株相互之间的差异很小，均与CPV-2a基因亚型达到99%以上，而广州分离株则差异稍大)，但CPV-2b亚型(广州分离株CPV-1130)也存在，并且有向新的CPV-2c亚型(广州分离株CPV-g15)进化的趋势。CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c在珠三角地区共存，但以CPV-2a亚型为主要优势流行病毒株。

[1]Dokia M,Fujita K,M iura R,et al.Sequence analysis of VP2gene of canine parvovirus isolated from domestic dogs in Japan in 1999and 2000[J].Comp Immunol M icrobiol Infect Dis,2006,29(4):199-206.

[2]Battilani M,Scagliarini A,Ciulli S,et al.High genetic diversity of the VP2gene of a canine parvovirus strain detected in a domestic cat[J].Virology,2006,352(1):22-26.

[3]Decaro N,Desario C,Parisi A,et al.Genetic analysis of canine parvovirus type 2c[J].Virology,2009,385(1):5-10.

[4]Ikeda Y,Nakamura K,M iyazawa T,et al.Feline host range of canine parvovirus:Recent emergence of new antigenic types in cats[J].Perspectives,2002,8(4):1-11.

[5]Pe'rez R,Francia L,Romero V,et al.First detection of canine parvovirus type 2c in South America[J].Vet M icrobiol,2007,124(1-2):147-152.

[6]Decaro N,Elia G,Martella V,et al.Characterisation of the canine parvovirus type 2variants using minor groove binder probe technology[J].JVirol Meth,2006,133(1):92-99.

[7]牛学锋.表达犬细小病毒VP2基因的嵌合狂犬病病毒生物学特性的研究[D].广东：华南农业大学，2009.

[8]Sook Hee Yoon,Wooseog Jeong,Hyun-Jeong Kim,et al,Molecular insights into the phylogeny of canine parvovirus 2(CPV-2)w ith emphasis on Korean isolates:a Bayesian approach[J].Arch Viol,2009,154:1353-1360.

[9]刘忠华，钟翎，张钰，等.PCR方法检测犬细小病毒生长动态及与其它方法的比较[J].上海实验动物科学，2000，22(1)：20-22.

[10]魏巍，李肖梁，帅江冰，等.犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定[J].畜牧与兽医，2008，40(7)：1-4.

[11]秦海斌，张汇东，缪勤，等.犬细小病毒血凝的检测和血凝抑制试验的优化[J].中国比较医学杂志，2009，19(7)：49-52.

[12]Truyen U.Evolution of canine parvovirus--a need for new vaccines?[J].Vet M icrobiol,2006,117(1):9-13.

[13]Perez R,Francia L,Romero V,et al.First detection of canine parvovirus type 2c in South America[J].Vet M icrobiol,2007,124(1-2):147-52.

[14]张仁舟，杨松涛，冯昊，等.中国国内首次检测到犬细小病毒CPV-2c[J].中国病原生物学杂志，2010，5(4)：246-275.