彝族虫类药日本琵琶甲的化学成分研究

晏永明，吕 青，董小萍 ，李 艳，程永现 *

1中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室，昆明 650204;2成都中医药大学药学院，成都 610075

日本琵琶甲(Blaps japonensis Marseul.)属鞘翅目(Coleoptera)拟步甲科(Tenebrionidae)琵琶甲族(Blaptini)琵琶甲属(Blaps)昆虫。日本琵琶甲又称臭壳子、臭屁虫、打屁虫等，在云南民间应用广泛，尤其是彝族治疗疑难杂症处方中常用的药用昆虫，具有抗菌、消炎、解毒、消包块、抗惊痫等作用［1］。目前国内外对其化学成分及生物活性研究较少，已有的研究表明同属昆虫中含有一些对苯二酚类和脂溶性成分等［2-5］。我们采用各种柱色谱从其50%乙醇提取物的正丁醇萃取部位分离得到10个化合物，所有化合物均系首次从该药用昆虫中分离得到。活性测试表明化合物1具有抑制脂多糖诱导的巨噬细胞一氧化氮产生作用。

1 仪器与材料

JASCO-20C型数字式旋光仪(日本);VG AUTO Spec-3000(英国VG公司)及Finnigan MAT 90质谱仪(德国 Finnigan公司);Bruker AM-400及 DRX-500 MHz核磁共振仪(TMS作为内标，δ为ppm，J为Hz);200～300目柱色谱用硅胶、硅胶H和GF254薄层色谱用硅胶(青岛海洋化工厂);45～75 μm MCI gel CHP 20P(日本三菱公司产品);25～100 μm Sephadex LH-20(Pharmacia公司);40 ～63 μm RP-18(日本Daiso)。石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、甲醇等有机溶剂均为工业纯经重蒸后使用。

日本琵琶甲样品购自云南花鸟市场(采集自云南元江)，由中国科学院昆明动物研究所董大志研究员鉴定，标本(CHYX-0469)存于中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室。

2 提取与分离

日本琵琶甲5 kg，粉碎，50%乙醇冷浸动态提取3次，每次2 d，过滤，减压回收乙醇得浸膏450 g，加水悬浮后依次用石油醚和正丁醇进行萃取，合并正丁醇萃取液，浓缩得到正丁醇部位140 g。正丁醇部位经硅胶柱色谱 (200～300目，1.5 kg)以氯仿－甲醇梯度洗脱得到5个组份 (Fr.1～Fr.5)。各组份经硅胶、MCI gel CHP 20P、Sephadex LH-20(甲醇)、RP-18反复柱层析，结合制备薄层色谱从由Fr.1获得9(20 mg)、7(10 mg)和 8(7 mg);Fr.2 获得 2(20 mg)、4(10 mg)和 6(12 mg);Fr.3 获得 1(5 mg)，Fr.4 获得3(40 mg)和10(5 mg)，Fr.5 获得5(12 mg)。

3 结构鉴定

图1 化合物1的主要HMBC和COSY相关Fig.1 Key HMBC and ROESY correlations of compound 1

3，4-Dihydroxyphenylacetic acid methyl ester(2)白色胶状物。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:6.72-6.59(3H，m，Ar-H)，3.49(2H，s，H-1')，3.63(3H，s，OCH3);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:125.9(C-1)，115.5(C-2)，143.1(C-3)，143.8(C-4)，116.3(C-5)，121.6(C-6)，40.4(C-1')，173.8(C-2')，52.4(OCH3)。以上数据与文献数值相符［7］。

Hydroxytyrosol(3) 白色胶状物。1H NMR(400 MHz，CD3COCD3)δ:6.70(1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，6.69(1H，d，J=8.1 Hz，H-5)，6.52(1H，dd，J=8.1，1.9 Hz，H-6)，2.63(2H，t，J=7.2 Hz，H-1')，3.65(2H，t，J=7.2 Hz，H-2')，7.81(2H，brs，Ar-OH);13C NMR(100 MHz，CD3COCD3)δ:131.7(C-1)，116.8(C-2)，144.1(C-3)，145.6(C-4)，115.9(C-5)，120.9(C-6)，39.6(C-1')，64.2(C-2')。以上数据与文献数值基本相符［8］。

3，4-Dihydroxy-β-methoxyphenethyl alcohol(4)白色胶状物。1H NMR(400 MHz，CD3COCD3)δ:6.80(1H，d，J=2.1 Hz，H-2)，6.78(1H，d，J=7.8 Hz，H-5)，6.63(1H，dd，J=7.8，2.1 Hz，H-6)，4.08(1H，dd，J=7.9，4.0 Hz，H-1')，3.55(1H，dd，J=11.3，8.2 Hz，H-2'a)，3.43(1H，brd，J=10.7 Hz，H-2'b)，3.58(1H，brs，2'-OH)，3.18(3H，s，OCH3)，7.88(1H，brs，Ar-OH);13C NMR(100 MHz，CD3COCD3)δ:132.1(C-1)，115.8(C-2)，145.5(C-3)，145.9(C-4)，114.7(C-5)，119.5(C-6)，86.7(C-1')，67.8(C-2')，56.6(OCH3)。以上数据鉴定化合物4结构为3，4-Dihydroxy-β-methoxyphenethyl alcohol，并对其核磁共振数据首次进行了归属。

(S)-(+)-2-(3，4-Dihydroxy phenyl)-2-ethoxylethanol(5) 白色胶状物。1H NMR(400 MHz，CD3COCD3)δ:6.81(1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，6.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.65(1H，dd，J=8.0，1.9 Hz，H-6)，4.20(1H，d，J=8.0，4.1 Hz，H-2')，3.37(4H，m，H-1，H-1'')，1.11(3H，t，J=7.0 Hz，H-2'')，3.66(1H，brs，2'-OH)，7.88(2H，brs，Ar-OH);13C NMR(100 MHz，CD3COCD3)δ:132.6(C-1)，114.6(C-2)，145.8(C-3)，145.4(C-4)，115.8(C-5)，119.3(C-6)，67.9(C-1')，83.7(C-2')，64.5(C-1'')，15.6(C-2'')。以上数据与文献数值相符［9］。

3-Hydroxy-4-methoxy-phenylmethylcarbinol(6)白色固体。1H NMR(500 MHz，CD3COCD3)δ:6.67(1H，d，J=3.0 Hz，H-2)，6.60(1H，d，J=8.6 Hz，H-5)，6.52(1H，dd，J=8.6，3.0 Hz，H-6)，4.65(1H，q，J=6.5 Hz，H-1')，1.33(3H，d，J=6.5 Hz，H-2')，3.23(3H，s，OCH3);13C NMR(100 MHz，CD3COCD3)δ:131.1(C-1)，115.6(C-2)，148.8(C-3)，151.4(C-4)，113.6(C-5)，117.1(C-6)，75.8(C-1')，22.6(C-2')，56.7(OCH3)。以上数据与文献数值相符［10］。

4-Hydroxybenzoic acid(7) 白色粉末。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:6.71(1H，d，J=8.5 Hz，H-3，5)，7.79(1H，d，J=8.5 Hz，H-2，6);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:127.7(C-1)，132.5(C-2，6)，115.5(C-3，5)，161.6(C-4)，174.1(COOH)。以上数据与文献数值相符［11］。

原儿茶醛(8) 白色粉末。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.30(2H，brs，H-2，6)，6.91(1H，brd，J=5.1 Hz，H-5)，9.67(1H，s，CHO);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:130.7(C-1)，116.2(C-2)，147.1(C-3)，153.7(C-4)，119.4(C-5)，126.5(C-6)，193.1(CHO)。以上数据与文献数值相符［12］。

Ethyl β-D-xylobioside(9) 白色固体。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:4.21(1H，d，J=7.0 Hz，H-1)，3.14(1H，m，H-2)，3.33(1H，t，J=8.1 Hz，H-3)，3.50(1H，overlap，H-4)，3.50(1H，overlap，H-5a)，3.21(1H，dd，J=11.0，9.8 Hz，H-5b)，3.80(2H，m，C-1')，1.14(3H，t，J=7.2 Hz，C-2');13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:104.3(C-1)，74.2(C-2)，77.3(C-3)，70.8(C-4)，66.0(C-5)，65.0(C-1')，15.4(C-2')。以上数据与文献数值相符［13］。

Butyl β-D-xylobioside(10)白色固体。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ:4.21(1H，d，J=7.0 Hz，H-1)，3.15(1H，m，H-2)，3.33(1H，t，J=8.2 Hz，H-3)，3.45(1H，overlap，H-4)，3.50(1H，overlap，H-5a)，3.17(1H，m，H-5b)，3.79(2H，m，C-1')，1.52(2H，m，H-2')，1.35(2H，q，J=7.6 Hz，H-3')，0.88(3H，t，J=7.4 Hz，H-4');13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:104.5(C-1)，74.1(C-2)，77.1(C-3)，70.7(C-4)，66.0(C-5)，69.4(C-1')，32.5(C-2')，19.8(C-3')，14.1(C-4')，以上数据与文献数值相符［13］。

4 活性测试

化合物1为具有五元不饱和内酯环的结构，为此我们对其进行了生物活性测试。应用脂多糖(LPS)和 IFN-γ刺激 RAW264.7细胞，然后应用Griess试剂测定细胞培养上清液中NO2-水平以反映诱导型一氧化氮合成酶的总体酶活。采用MTT［14］法测定细胞存活量，应用 Reed and Muench［15］法计算化合物的IC50值。结果表明化合物1可显著抑制LPS诱导的RAW264.7产生一氧化氮，其IC50值为14.8 μg/mL，提示化合物1可能具有抗炎或抗肿瘤作用，与该昆虫的传统功效有密切关联。

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