黄酮类化合物清除羟自由基(HO·)功能及其构效关系研究

郭春梅，刘淑清，郭一萌，鱼红闪，孙明忠*

1大连医科大学生物技术系;2大连医科大学生物化学与分子生物学教研室，大连 116044;3大连工业大学生物工程学院，大连 116034

生物体在新陈代谢过程中会产生大量的自由基，自由基是具有未成对电子的原子团，具有很强的氧化活性。自由基的种类包括超氧阴离子自由基)、羟自由基 (HO·)等［1-4］。自由基可攻击蛋白质、DNA、脂类、核苷酸、碳水化合物等，诱导氧化损伤，导致癌症、高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、心肌梗塞、机体老化等多种疾病［5-7］。

黄酮类化合物是一种天然多酚类植物化学物，基本母核为2-苯基色原酮类化合物，由两个苯环(A环和B环)通过中间杂环吡喃或吡喃酮相连接，即具有15个相连碳原子核心结构的化合物［8，9］。根据取代基团的不同，可以分为黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、二氢异黄酮等［10-12］。黄酮类化合物具有多种生物学活性，如抗炎、抗自由基、抗氧化、抗血小板聚集、抗肿瘤、抗病毒、降压、降血脂等作用，可以预防和治疗心脑血管疾病［13，14］。黄酮类化合物是一类有效的天然抗氧化剂，对氧自由基有较好的清除作用，具有抗自由基损伤和保护机体各组织的作用，而黄酮类化合物结构上的差异会导致其生物学活性的变化，其抗自由基能力完全依赖于其特殊的结构［15-17］。

我们采用体外实验的方法，通过Fenton反应体系产生HO·，系统地研究了八种黄酮类植物化学物槲皮素 (quercetin)、异槲皮素 (isoquercitrin)、芦丁 (rutin)、橙皮素 (hesperetin)、橙皮苷 (hesperidin)、柚皮素 (naringenin)、柚皮苷 (naringin)和淫羊藿苷(icariin)(图1)对HO·的清除作用。通过作用活性比较，探讨黄酮类化合物抗HO·的作用及其构效关系，为选择有效的黄酮类化合物预防和治疗相关疾病提供一定实验基础，并为其进一步开发和临床应用提供实验理论依据。

图1 八种黄酮类植物化合物化学结构Fig.1 The chemical structures of eight flavonoid phytochemicals

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

槲皮素、异槲皮素、芦丁、橙皮素、橙皮苷、柚皮素、柚皮苷和淫羊藿苷由大连工业大学提供;硫酸亚铁(FeSO4)，过氧化氢 (H2O2)，水杨酸，无水乙醇和二甲基亚砜 (DMSO)均为国产分析纯;UV-754分光光度计为上海菁华科技仪器有限公司产品。

1.2 黄酮类植物化学物纯度分析

取八种黄酮类化合物各0.55 mg，分别用2 mL甲醇溶解，0.2 μm 过滤器过滤后，分别取 10 μL 样品用Waters 2690/996高效液相色谱仪(HPLC)检测其纯度。色谱条件:Intersil ODS-3 C18色谱柱(4.6 × 250 mm);流动相:甲醇:0.2%磷酸 (60∶40);柱流速:1.0 mL/min;检测波长:槲皮素、异槲皮素、芦丁、柚皮素和柚皮苷采用254 nm，橙皮素和橙皮苷为283 nm，淫羊藿苷为270 nm;柱温25℃。

1.3 黄酮类植物化学物对HO·清除作用

Fenton反应是对生物体内HO·清除的体外模拟反应:Fe2++H2O2→Fe3++HO· +OH-。HO·氧化水杨酸产生有色物质2，3-二羟基苯甲酸，后者在510 nm处有强吸收。若在反应体系中加入具有清除HO·的物质，便会与水杨酸竞争HO·，从而使有色生成物减少，吸光度降低。在反应体系中加入1.5 mM的FeSO4溶液，9 mM的水杨酸乙醇溶液和用DMSO配制的八种黄酮类化合物溶液各1 mL，最后加入1 mL 9 mM的H2O2溶液启动反应。考虑到黄酮类化合物本身的吸光度，实验中用1.5 mM的FeSO4溶液，9 mM的水杨酸乙醇溶液和八种黄酮类化合物溶液及三蒸水各1 mL体系作为本底吸收。37℃反应0.5 h后，在510 nm处测吸光度。其HO·的清除率(%)=［A0-(AX-AX0)］/A0*100%，A0为对照试验的吸光度值，Ax为加入黄酮类化合物溶液的吸光度值，Ax0为作为本底吸收的吸光度值。所有实验结果是三次测定数据的平均值。

1.4 统计学分析

用SPSS11.5统计软件对实验数据进行统计分析，结果用均数加减标准差(X±S)表示，差异检验用方差分析和t检验，P＜0.05表示差异有显著性。

2 结果与讨论

2.1 黄酮类植物化学物纯度分析

通过计算HPLC峰面积和峰强度，得到八种黄酮类化合物的纯度均超过95%(表1)，说明用于本实验的黄酮类化合物是高纯度的，确保了实验结果的可信度、准确性。

表1 八种黄酮类植物化学物纯度HPLC检测结果Table 1 The purity determinations of eight flavonoid phytochemicals by HPLC

Isoquercitrin(异槲皮素) 4.512 ±0.012 97.12 ±0.016 97.20 ±0.020 Rutin(芦丁) 4.404 ±0.009 99.33 ±0.027 99.33 ±0.023 Naringenin(柚皮素) 7.379 ±0.021 95.64 ±0.017 95.10 ±0.019 Naringin(柚皮苷) 4.261 ±0.009 95.06 ±0.036 95.31 ±0.025 Hesperetin(橙皮素) 7.833 ±0.015 95.85 ±0.032 95.02 ±0.027 Hesperidin(橙皮苷) 4.350 ±0.016 96.53 ±0.022 96.78 ±0.034 Icariin(淫羊藿苷)9.781 ±0.019 96.85 ±0.025 96.29 ±0.028

2.2 不同浓度槲皮素对HO·清除作用

HO·是人体中最活跃、对机体危害最大的自由基，它可与脂类、蛋白质、DNA等反应，引发不饱和脂肪酸氧化，形成脂质过氧化物 (LPO)，破坏膜结构，导致细胞和组织器官损伤，诱发多种疾病［18］。槲皮素对Fenton体系产生的HO·具有一定清除作用，并呈现明显的剂量效应，在实验浓度范围内(19.89 ～662.91 μM)，随着槲皮素浓度的增加，对HO·的清除作用也增强 (图2)。

图2 不同浓度槲皮素对HO·清除作用Fig.2 The HO·scavenging activity of different concentrations quercetin

2.3 黄酮类植物化学物对HO·清除作用

黄酮类化合物种类繁多，并不是所有的黄酮类化合物都具有清除自由基的功能，其抗自由基能力完全依赖于其特殊结构。在浓度260 μM时，八种黄酮类化合物中只有槲皮素、异槲皮素和芦丁对HO·呈现明显的清除作用，橙皮素、橙皮苷、柚皮素、柚皮苷和淫羊藿苷不呈现清除HO·的功能(图3)。槲皮素清除HO·的作用最强，清除率为30.69%，其次为芦丁13.70%，异槲皮素稍小为10.23%(表2)。

图3 八种黄酮类植物化学物对HO·清除作用Fig.3 The HO·scavenging activity of eight flavonoid phytochemicals

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黄酮类化合物酚羟基的氢原子直接参与自由基的清除，可将自身氢原子供给自由基，使自由基氧化活性减弱，而自身则成为黄酮自由基，黄酮自由基的稳定性较高，难以对其他分子造成破坏。所以黄酮类化合物清除自由基的能力与作为活泼的氢供体的酚羟基有着密切的关系，故黄酮类化合物酚羟基数目越多，提供氢质子能力越强，黄酮类化合物清除自由基能力就越强［8，19，20］。八种黄酮类化合物中，槲皮素有5个自由酚羟基，其酚羟基数目最多，所以槲皮素呈现最强的清除HO·的能力。

C环C3羟基也是抗自由基的活性基团，这与C环C3羟基在失去一个质子后，由于结构中的共轭作用及C环上的羰基的吸电子作用，而使其更加稳定相关［19-22］。槲皮素与异槲皮素和芦丁的结构差异在于C环C3位上基团的不同，槲皮素为羟基，而异槲皮素和芦丁分别为O-(-Glc和O-Glc-(-Rha糖苷基。由于C环C3位羟基的缺失，异槲皮素和芦丁清除HO·的能力比槲皮素分别降低了～66.67%和～55.36%。由此可见:C环C3位羟基基团是黄酮类化合物抗HO·的关键活性基团。

黄酮类化合物中各羟基活性相差很大，其中B环3’-4’邻位二羟基结构活性最高，而A环上的羟基活性最弱。B环上的3’-4’邻位二羟基，在失去氢后，可以形成分子内氢键或是通过共轭形成邻苯醌结构，从而降低了分子的自由能提高稳定性［14，17］。橙皮素、柚皮素、橙皮苷和柚皮苷四种黄酮类化合物都不具有清除HO·的作用，其结构的差别主要是苷及其苷元的差别，即橙皮苷和柚皮苷A环的C7位由相应苷元的羟基取代变为糖苷基取代，结构上的变化对它们清除HO·的作用影响不大，即说明A环C7位羟基不是黄酮类化合物抗HO·的活性基团。通过淫羊藿苷与柚皮苷的结构比较，可以得出C环C2-C3双键对抗HO·的活性作用不大。由先前比较可知，A环C7位羟基和C环C2-C3双键不是黄酮类化合物抗HO·的活性基团，所以异槲皮素、芦丁和橙皮素的比较主要看B环3’-4’邻位二羟基结构，可以得出B环3’-4’邻位二羟基结构也可能是黄酮类化合物抗HO·的关键基团。

总之，黄酮类化合物清除自由基的作用与酚羟基有很大的关系，其酚羟基数目、C环C3位羟基和B环3’-4’邻位二羟基在一定程度上影响着它们的抗自由基活性。本研究有助于揭示黄酮类化合物中不同的羟基基团与清除HO·之间的关系，其确切机制还有待进一步研究。

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