绿茶水提物中主要次生代谢产物的分离纯化与结构鉴定

吴 慧，张 梁，朱圣洁，张正竹

安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术教育部重点实验室，合肥 230036

茶叶(Camellia sinensis)中的化学成分因气候、季节、品种及叶龄的不同而有很大差异，主要以嘌呤类生物碱、鞣酸、酚酸类、儿茶素类、黄酮类以及黄烷醇聚合物为主［1，2］。但是，不同茶类之间，化学成分存在差异，绿茶因为是不发酵茶，因此保留了较多鲜叶中的天然成分，特别是茶多酚、咖啡碱和叶绿素等。生物碱和儿茶素类是绿茶的主要生物活性成分，儿茶素类化合物主要有表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、儿茶素(C)、儿茶素没食子酸酯(CG)、没食子儿茶素(GC)及没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)。绿茶叶中以EGCG含量最高，占多酚类物质的48% ～55%［3］。咖啡碱含量约占鲜叶干重的2%～5%。

绿茶相对于其他茶类保留了大量的多酚类化合物，因而被认为具有较高的健康价值［4，5］;有研究证实绿茶具有抗诱变、抗癌、抗畸变等作用［6，7］，而这些健康成分大都存在于茶汤中。为深入了解绿茶水提物中的功能性成分，建立绿茶水提物中主要次生代谢产物的化合物标准库，本文对绿茶水提物中的主要特征成分进行了分离和结构鉴定。

1 材料与仪器

1.1 材料

选用2010年加工的安徽皖南地区炒青绿茶;Sephadex LH-20(Pharmacia公司);Amberlite XAD-2大孔吸附树脂(美国Sigma公司);硅胶H(青岛海浪硅胶厂)。

1.2 仪器

旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司);电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司);真空干燥箱(德国MMM公司);高效液相色谱仪(美国Waters-600型);电子天平(上海天平仪器厂T6328B型);核磁共振仪(Varian 500MHz核磁共振分析仪器);液质联用仪(Agilent 1200 series LC-MSD)。

2 提取与分离

称取绿茶2 kg，用20 L开水浸泡15 min，反复提取两次，过滤取滤液。绿茶水提取液10 L过大孔树脂柱，柱体积1.5 L，先用足量的纯水将样品中的糖冲洗干净，然后依次用比例为10%、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇溶液洗脱，分别得到6个组分。将经过40%甲醇溶液洗脱得到的Fr.样品(57 g)进行硅胶柱层析，分级洗脱(甲醇∶氯仿=14% ～33%)，TLC薄层色谱分析合并后得5个组分Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5，Fr.1过凝胶柱(丙酮∶水 =1∶1洗脱)得到化合物1、Fr.6和 Fr.7。Fr.6组分(13 g)经硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶丙酮∶水 =7∶1.5∶1∶0.1 洗脱)得到 Fr.8、Fr.9 和 Fr.10，Fr.8 经凝胶层析(甲醇洗脱)得到化合物6。Fr.10经凝胶层析(甲醇洗脱)得到Fr.12和Fr.13两个组分，Fr.12经凝胶层析(甲醇洗脱)得到化合物3、化合物7和Fr.14，Fr.14再经凝胶层析(甲醇洗脱)得到化合物2。Fr.7组分(17 g)经硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶水=4∶1∶0.1 洗脱)得到 Fr.16 和 Fr.17(0.4246 g)，Fr.17再经硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶水∶甲酸 =10∶1∶0.1∶0.025洗脱)得到化合物4和化合物8。Fr.4组分(0.9 g)经硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶水∶甲酸=6∶1∶0.1∶0.2 洗脱)得到 Fr.19 和 Fr.20，Fr.20经凝胶层析(甲醇洗脱)纯化后得到化合物5。

图1 化合物1～8的化学结构Fig.1 Chemical structures of compounds 1-8

3 结构鉴定

化合物1 白色针状结晶;ESI-MS(Positive)m/z:195［M+H］+;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.51(1H，s，H-8)，3.99(3H，s)，3.58(3H，s)，3.41(3H，s)。1H NMR数据与文献报道的咖啡碱［8］一致。

化合物2 灰白色无定形粉末;ESI-MS(Negative)m/z:441［M-H］-;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:6.92(2H，s，H-2＇＇，H-6＇＇)，6.90(1H，d，J=1.9 Hz，H-2＇)，6.77(1H，dd，J=8.3，1.8 Hz，H-6＇)，6.67(1H，d，J=8.2 Hz，H-5＇)，5.94(2H，s，H-6，H-8)，5.49(1H，s，H-3)，4.99(1H，s，H-2)，2.82-2.96(2H，m，H-4)。1H NMR 数据与文献报道的儿茶素没食子酸酯［9］一致。

化合物3 棕色无定形粉末;ESI-MS(Negative)m/z:289［M-H］-;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:6.98(1H，d，J=1.7 Hz，H-2＇)，6.80(1H，dd，J=8.2，1.7 Hz，H-6＇)，6.76(1H，d，J=8.1 Hz，H-5＇)，5.95(1H，d，J=2.3 Hz，H-6)，5.92(1H，d，J=2.3 Hz，H-8)，4.82(H，s，H-2)，4.18(1H，s，H-3)，2.86(1H，dd，J=16.7，4.6 Hz，H-4b)，2.74(1H，dd，J=16.8，2.7 Hz，H-4a)。1H NMR 数据与文献报道的表儿茶素［10］一致。

化合物4 白色无定形粉末;ESI-MS(Negative)m/z:183［M-H］-;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:7.05(2H，s，H-2，H-6)，4.84(br s，OH)，3.82(3H，s，OCH3)。1H NMR 数据与文献报道的 3，5-二羟基-4-甲氧基苯甲酸［11］一致。

化合物5 黄色无定形粉末;ESI-MS(Negative)m/z:447 ［M-H］-，ESI-MS(Positive)m/z:471［M+Na］+，分子量为 448;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:8.09(2H，d，J=8.8 Hz，H-2＇，6＇)，6.88(2H，d，J=8.8 Hz，H-3＇，5＇)，6.41(1H，d，J=1.5 Hz，H-8)，6.21(1H，d，J=1.7 Hz，H-6)，5.14(1H，d，J=7.8 Hz，H-1＇＇)，3.44-3.79(m，sugar-H)。1H NMR数据与文献报道的山柰酚-3-葡萄糖苷［12］一致。

化合物6 灰白色无定形粉末;ESI-MS(Negative)m/z:457［M-H］-;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:6.95(2H，s，H-2＇＇，H-6＇＇)，6.71(2H，m，H-2＇，H-6＇)，6.01 – 5.95(2H，m，H-6，H-8)，5.52(1H，d，J=1.8 Hz，H-3)，5.07(1H，d，J=10.1 Hz，H-2)，3.01(1H，dd，J=17.4，4.4 Hz，H-4a)，2.93 ～2.82(1H，m，H-4b)。1H NMR数据与文献报道的没食子儿茶素没食子酸酯［10］一致。

化合物7 灰白色无定形粉末;ESI-MS(Negative)m/z:289 ［M-H］-;UV λmax nm(MeOH):225，280;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:4.48(br，d，J=7.5 Hz，H-2)，3.81(br，m，H-3)，2.65(dd，J=6.0，16.0 Hz，H-4a)，2.34(dd，J=6.0，16.0 Hz，H-4b)，5.89(d，J=2.0 Hz，H-6)，5.69(d，J=2.0 Hz，H-8)，6.72(d，J=2.0 Hz，H-2＇)，6.69(d，J=7.5 Hz，H-5＇)，6.60(dd，J=2.0 Hz，7.5 Hz，H-6＇)。1H NMR 数据与文献报道的儿茶素［10］一致。

化合物8 白色针状结晶;ESI-MS(Negative)m/z:169 ［M-H］-;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.03(2H，s，H-2，H-6)。1H NMR 数据与文献报道的没食子酸［13］一致。

4 讨论

本实验从绿茶中分离得到了8个化合物，研究表明绿茶末中仍然含有大量的多酚类物质，可以作为茶多酚类的提取原料，应用于保健食品等多个领域。

1 Perva-Uzunalic＇A，Škerget M，Knez Ž，et al.Extraction of active ingredients from green tea(Camellia sinensis):extraction efficiency of major catechins and caffeine.Food Chem，2006，96:597-605.

2 Leung AY，Foster S.Encyclopedia of common natural ingredients used in food，drugs，and cosmetics，2nd ed.New York:John Wiley ＆ Sons，1996.489-491.

3 Ho CT，Chen CW，Wanasundara UN，et al.Natural antioxidants from tea in natural antioxidants.Champaign，IL:AOCS Press，1997.213-223.

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5 McKay DL，Blumberg JB.The role of tea in human health:an update.J Am Coll Nutr，2002，21:1-13.

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7 Kuroda Y，Hara Y.Antimutagenic and anticarcinogenic activity of tea polyphenols.Mutat Res-Rev Mutat，1999，436:69-97.

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13 Nawwar MAM，Buddrus J，Bauer H.Dimeric phenolic constituents from the roots of tamarix nilotica.Phytochemistry，1982，21:1755-1758.