牛脑海马NGF分离纯化及微量元素含量检测

顾鹏毅，代 萌，杨 栋，高 娜，李宁禾，孙晋民*

1中国医科大学实验技术中心一部暨国家中医药管理局中药生物工程科研Ⅲ级实验室，沈阳 110001;2朝阳市卫生学校，朝阳 122000

神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是神经营养因子家族中最早被发现，具有神经元营养和促进突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，其临床应用前景广阔。NGF对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用［1］。NGF具有多种营养性生物学效应，表现在对胚胎发育期神经元的作用，促进生后发育神经元的生长，维持成熟神经元的存活，促进神经损伤的修复与再生，对神经变性性疾病的作用，对肿瘤的潜在性治疗作用，在炎性疾病中的作用以及在糖尿病周围神经病变中的治疗作用。微量元素锌是NGF的重要结构元素，在脑中的分布不均衡，其中尤以海马结构最高。目前，NGF的主要来源是雄性小鼠的颌下腺、蛇毒、豚鼠前列腺、牛精液等，临床较多的采用小鼠颌下腺、蛇毒来源以及基因工程产品人重组NGF(rhNGF)，其对人的神经组织有明显的作用，国内外文献已有很多报道。牛脑体积较大，来源广泛，以牛脑为原料分离纯化NGF或将成为其另一重要来源。本研究从新鲜牛脑中分离纯化NGF，并进行活性检测，以期为进一步应用性研究打好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要药品、试剂

新鲜牛脑;标准品 rhNGF(Sigma);NGF抗体(Sigma);磷酸盐缓冲液(0.2 M，pH 6.8);醋酸盐缓冲液(0.2 M，pH 4.0);Tris-HCl缓冲液(0.05 M，pH 9.0);PC12细胞(ATCC:CRL-1721，购于中国科学院上海细胞库)。

1.1.2 仪器

层析系统(ÄKTA purifier 100，GE);原子吸收分光光度计(180-80，Hitachi);电泳凝胶成像系统(CHEMI IMAGER 5500);Motic Imang Andvaned 3.2图像分析系统等。

1.2 方法

1.2.1 粗提物的制备

取新鲜牛脑海马，经匀浆、均质得乳白色悬浊液，离心13000 rpm ×30 min，得粗提物上清液，80%(NH4)2SO4沉淀，离心弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲液(0.2 M，pH 6.8)溶解。

1.2.2 分离纯化

将盐析后的溶液置于透析袋中，醋酸盐缓冲液(0.2 M，pH 4.0)透析过夜，将透析后的液体离心12000 rpm ×5 min，取上清液，用CM-FF层析柱进行离子交换层析。

1.2.3 Western Blot及活性测定

1.2.3.1 Western Blot

选用T=10%，C=3%的SDS-PAGE，一抗为兔的β-NGF单克隆抗体，二抗为羊抗兔的IgG，碱性磷酸酶显色法显色。

1.2.3.2 活性测定［2-5］

用PLL包被24孔板，含3%马血清、12%胎牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为3×103个/mL，得到PC12细胞悬液。每孔加入100 μL试样，100 μL 0.1 M 乙醇，800 μL 细胞悬液，37 ℃，5%CO2孵育72～120 h后，显微镜观察细胞形态变化。利用Motic Imang Andvaned 3.2图像分析系统，测量细胞分化情况，选取3个视野的细胞/细胞团，分别测量每个视野中分化细胞的最长轴突的长度，计算出每个浓度下的最长轴突的平均值及标准差。以轴突生长长度大于细胞最大直径为细胞已分化标准，计数各视野细胞，若在该浓度下≥95%的PC12细胞已分化，认为该浓度具有生物学活性。

1.2.4 微量元素的测定

利用原子吸收分光光度计测定其微量元素，根据 Zn、Fe、Cu 的标准溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL)将测定结果绘制标准曲线，并根据标准曲线分别测定粗提物和CM2组分中的Zn、Fe、Cu的含量。

1.2.5 统计学处理

利用SPSS17.0统计学软件，进行t检验及χ2检验。

2 结果

2.1 分离纯化

牛脑海马粗提物经起始缓冲液透析过夜，再经CM柱离子交换层析，在起始缓冲液和洗脱缓冲液的作用下，得到穿透峰和2个洗脱峰:CM1峰、CM2峰，其中CM2峰在pH值陡然上升时出现，且蛋白浓度相对较高，为NGF的主要含量峰，其层析结果见图1。

图1 离子交换层析结果Fig.1 Ion-exchange chromatogram of bovine brain hippocampus

2.2 Western Blot及活性测定

2.2.1 Western Blot

结果显示55 KD、70 KD左右位置有两条清楚带，均含有β亚基，如图2所示。

图2 Western Blot结果图Fig.2 Western Blot of NGF

2.2.2 生物活性检测

2.2.2.1 标准品测定结果

各实验组均长出纤维突触，灵敏度可达1 ng/mL，0.1 M乙醇有较好的促分化作用。标准品NGF在浓度1～5 ng/mL时使PC12细胞长出纤维突触，细胞体积增大，核清晰，可见核仁。分别对1、2、4、5和10 ng/mL浓度下细胞分化情况进行测量，测量结果分别为 40.29 ± 3.43 μm、54.34 ± 12.15 μm、186.66 ± 7.91 μm、240.38 ± 32.07 μm、181.62 ±20.31 μm，5 ng/mL的浓度对PC12细胞的诱导效果最佳，见图3-B。

2.2.2.2 分离组分测量结果

分别对标准品NGF、粗提物、透析后组分、CM1组分和CM2组分作用下的细胞分化情况进行测量，选取3个视野的细胞/细胞团，分别测量每个视野中分化细胞的最长轴突的长度，测量结果见表1，其中CM2组分作用下的细胞轴突生长情况如图3-C所示。CM2组分促PC12细胞轴突生长作用不及5 ng/mL标准品NGF，但满足判定标准，其效果优于2 ng/mL标准品NGF。

图3 标准品NGF及CM2组分对PC12细胞分化的作用(A.空白对照组;B.5 ng/mL NGF标准品组;C.CM2分离组分组)Fig.3 PC12 cell differentiation effects of NGF standard and CM2 component(A.Blank control;B.5 ng/mL NGF standard;C.CM2 component)

表1 标准品NGF及分离组分的蛋白浓度和生物学活性()Table 1 Protein concentration and biological activity of NGF standard and purified components)

表1 标准品NGF及分离组分的蛋白浓度和生物学活性()Table 1 Protein concentration and biological activity of NGF standard and purified components)

*ND意为未检测到(ND means not detected).

组分Components蛋白浓度Protein concentration(mg/mL)PC12细胞分化最长轴突长度The length of the longest axon of PC12 cell differentiation(μm)标准品NGF NGF standard 5×10-6240.38±32.07粗提物Crude extract 8.107 10.32±4.51透析Dialysis 1.105 39.21±3.43 CM2component 0.4856 107.90±10.33层析Chromatography CM1组分CM1component 0.2372 ND*CM2组分

图4 牛脑海马粗提物与CM2组分中Zn、Fe、Cu含量Fig.4 The content of Zn，Fe，Cu in crude extracts of the bovine hippocampus and CM2 component

2.3 微量元素测定结果

分别对牛脑海马粗提物及CM2组分进行微量元素的测定，经t检验表明:牛脑海马粗提物的微量元素中Zn与Cu含量无差别，Fe与Zn、Cu有差异(P ＜0.01)，见图4-A;CM2组分中Zn远高于Fe、Cu含量(P ＜0.01)，Fe与Cu含量无差异，见图4-B。

3 讨论

本实验得到的牛脑海马NGF的分子量在55 KD、70 KD左右，为较大分子量的 NGF，与牛精浆［6］、人胎脑、大鼠脑［7］来源的 NGF 相比，含有的亚基不同。用标准品NGF对PC12细胞诱导发现，5 ng/mL的浓度下，诱导分化效果最佳。我们据此建立促神经生长物质检测技术平台［3，4］，应用 0.1 M乙醇作为诱导剂，以5 ng/mL的标准品NGF浓度为阳性对照;采用图像分析软件，测量分化细胞的最长轴突的长度以及分化细胞的百分含量;根据对已分化细胞的直径测量，以最长轴突大于50 μm时且分化细胞的百分含量＞50%作为标准。

必需微量元素是正常人体生命过程中不可缺少的元素，它参与人体的重要的生命活动过程，对人体的各种生理活动起影响、调节作用。锌在中枢神经系统内有两种存在形式，一种是与某些生物大分子牢固结合，如金属蛋白酶中的锌;另一种形式是与组织成份疏松结合，可以被鳌合剂螯合。锌与机体的神经内分泌有一定关系，海马有损伤出现时，可导致下丘脑释放激素等活性物质的水平发生改变。锌对脑中的一些功能蛋白有调节作用，脑中可能有一种对神经细胞增殖起抑制作用的含锌蛋白，该蛋白与Alzheimer＇s痴呆的发生密切相关。锌能促进酶和蛋白质合成，加速细胞的分裂和增殖，增加能量代谢、组织呼吸和保护细胞膜的完整性。微量元素锌在脑中的分布是不均衡的，以边缘系统、皮质部、扣带回、齿状回和海马中含量较多，其中尤以海马结构和大脑皮层含量最高，啮齿类动物的海马锌含量可高达133 μg/g干重。经检测牛脑海马NGF中的微量元素Zn明显高于Fe、Cu含量，这与NGF分子中含有Zn结构相一致，Zn2+具有稳定亚单位结构的作用。

神经生长因子具有促进神经纤维生长、调节神经多肽的合成和表达的作用。目前研究表明，NGF是表皮角质形成细胞增殖诱导剂［8］，对正常及瘢痕皮肤成纤维细胞的生长趋势与增殖活性有明显的促进作用，促进皮肤创伤修复和创面愈合，对瘢痕皮肤的作用尤为明显［9］。陈丽华等［10］研究发现NGF可以间接调节并增强面部皮肤的免疫功能，局部创面应用后不但可以趋化各种免疫细胞，而且能对被趋化的免疫细胞致敏。有研究表明，NGF能影响肥大细胞的活性［11］，或许通过肥大细胞参与湿疹的发病。NGF作为一种生长因子，能促进细胞有丝分裂，对神经损伤有修复作用，同时还可促进伤口愈合［12］。同时还通过刺激皮肤的表皮细胞增殖、更新，刺激真皮的胶原蛋白增生以实现其促进伤口愈合等功能。我们课题组利用NGF研制的外用药精制蛇毒酶乳膏，取得了良好的临床效果。该项成果已获得国家发明专利，这为NGF在外用药方面的研究打下坚实的基础。本研究是我们NGF研究系列之一，将为进一步深入研究提供理论依据。

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