稻曲球脂溶性成分及其抗细菌和抗氧化活性

刘志强，王 平，单体江，孙伟波，刘 浩，孙文献，周立刚*

1湖南科技大学生命科学学院;2湖南科技大学化学化工学院，湘潭 411201;3中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193

稻曲病(Rice false smut)是危害水稻的一种重要的真菌病害［1］。稻曲病病原为稻绿核菌，无性态学名为Ustilaginoidea virens(Cooke)Takahashi。有性态学名为Villosiclava virens(Nakata)Tanaka et Tanaka［2］。迄今，稻曲病菌中已阐明的次生代谢产物有两类，第一类为黑粉菌素(Ustilaginoidins)，属于萘并吡喃酮类;另一类为稻曲菌素(Ustiloxins)，属于环肽类［3，4］。研究表明，稻曲菌素能够抑制真核生物微管蛋白的组装与细胞骨架的形成，抑制细胞有丝分裂，具有明显的抗肿瘤活性，作为抗肿瘤药物的开发具有较好的应用前景［5-7］。我国对稻绿核菌中次生代谢产物的研究还十分初步，仅见对其粗提物的报道［8，9］。稻绿核菌在水稻穗部为害，形成主要由厚垣孢子和菌丝组成的稻曲球。尚未见稻曲球脂溶性成分的研究报道，本研究制备了稻曲球石油醚提取物，采用水蒸气蒸馏法制备了石油醚提取物的油状物，同时从石油醚提取物中分离到3个单体化合物，对其进行了抗细菌和抗氧活性的测定，为稻曲球脂溶性成分的开发和利用提供依据，同时也为系统了解稻曲球中次生代谢产物的种类提供基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

稻曲球于2010年9月底采自辽宁省东港市，室温晾干，于-20℃保存备用。

1.2 仪器与试剂

水蒸气蒸馏装置(北京永光明医疗器械厂);GC-MS联用仪(Agilent 6890 GC-5973 MSD，美国安捷伦公司);Bruker Avance DPX-300型和DRX-400型核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司);Apex IV型飞行时间质谱仪(瑞士Bruker公司);VSP-3050型中低压液相色谱仪(东京理化器械株式会社);XT4-100B型显微熔点测定仪(北京科仪电光仪器厂);PowerWave HT多孔板分光光度计(美国BioTek公司)。

甲醇、石油醚、丙酮、氯仿、二氯甲烷等均为市售分析纯;薄层层析硅胶(GF254)和柱层析硅胶(60～80目和200～300目)均购自青岛海洋化工有限公司;CDCl3(北京腾达远科技有限公司);Sephadex LH-20(Pharmacia公司);噻唑蓝(MTT，美国Amresco公司);硫酸链霉素(Serva公司);其他试剂均为分析纯。

1.3 化合物分离与纯化

稻曲球6.0 kg，粉碎后用甲醇室温(25℃)浸泡3次，每次7 d，合并滤液并浓缩至干(1964 g)，然后加入适量蒸馏水制成悬浮液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行液-液萃取，重复5次，合并萃取液并浓缩成浸膏。分别得石油醚萃取物310 g，乙酸乙酯萃取物136 g，正丁醇萃取物318 g，水层浓缩成浸膏1200 g。将石油醚萃取部分经水蒸气蒸馏，得油状物 21.7 g。

将石油醚萃取物浸膏经硅胶柱层析，石油醚-丙酮(3∶1，v/v)洗脱，合并部分经二氯甲烷-甲醇梯度(1∶0→0∶1，v/v)洗脱，经 Sephadex LH-20 凝胶柱层析和重结晶，得化合物1(30 mg)、化合物2(25 mg)和化合物3(8.5 mg)。

1.4 油状物的GC-MS分析

GC条件:6890N Network气相色谱仪(Agilent);色谱柱为HP-5石英毛细管柱(30 m ×0.25 m ×0.25 μm，Agilent)。进样口温度 250 ℃，传输线温度240℃。程序升温如下:起始柱温50℃停留1.5 min;以10℃/min升至180℃，停留2 min;然后以6℃/min升至280℃，停留10 min。载气为高纯氦(99.999%);柱流量 1 mL/min。进样量 1.0 μL(分流比为 1∶20)。

MS条件:离子源温度280℃;电离方式EI，电离能量70 eV;质量扫描范围m/z 50～500 amu。

采用GC峰面积归一化法确定各组分峰相对含量(Relative content)。依据C8-C40各正烷烃的保留时间，按Van den Dool和Kratz法来确定保留系数(Retention index，RI)［10］。各组分峰用 NIST Library(2002版)质谱库进行检索，最后以质谱匹配度和RI值匹配度最高的化学结构为最佳鉴定结果，无RI值匹配的采用质谱匹配度最高的化学结构。

1.5 抗细菌活性测定

所用的供试微生物枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis;缩写为B.s.)为革兰氏阳性细菌;黄瓜角斑病菌(Pseudomonas lachrymans，缩写为 P.l.)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens，缩写为 A.t.)、番茄疮痂病菌(Xanthomonas vesicatoria，缩写为 X.v.)为革兰氏阴性细菌。采用多孔板-MTT分光光度法测定样品对细菌的最低抑制浓度(MIC)值［11］和半抑制浓度(IC50)值［12］，以硫酸链霉素为阳性对照。数据处理参考相关文献［13］，根据抑制率(%)，查几率值表，可得抑制率几率值(Y)，将化合物浓度(μg/mL)换算成浓度对数(X)，即可求出线性方程(Y=aX+b)，根据线性方程可求出样品的半抑制浓度(IC50)。

1.6 抗氧化活性测定

采用样品对Fe2+螯合能力来评价其抗氧化活性［18］，具体测定步骤如下:先向96孔板中加入30 μL浓度为0.2 mg/L的FeCl2·4H2O溶液，然后加入50 μL不同浓度的样品溶液，混合后再加入70 μL浓度为2.0 mg/L的菲啰嗪溶液，振荡混匀，室温下反应10 min，然后用多孔板分光光计测定其在560 nm处的吸收值，每个处理4个重复，以乙二胺四乙酸(EDTA)为阳性对照。数据处理参考文献［13，14］，设供试样品浓度(μg/mL)为 Y，Fe2+螯合率(%)为X，求得Fe2+螯合率回归方程(Y=aX+b)，从而可以求出样品对Fe2+螯合能力的有效中浓度(EC50)。

2 结果与分析

2.1 稻曲球石油醚提取物油状物的化学组成

通过水蒸气蒸馏，从稻曲球石油醚提取物中获得21.7 g油状物，占石油醚提取物重量的7.0%，占稻曲球重量的0.36%(以干重为基础)。通过GCMS分析，各组分峰用NIST Library(2002版)质谱库进行检索，共鉴定出14个成分，占总量的99.9%。采用GC峰面积归一化法定量分析，计算出各成分的相对含量(见表1)，主要成分为14-甲基十五烷酸甲酯(30.09%)、棕榈酸(10.52%)、10，13-十八碳二烯酸甲酯(37.31%)、十八烷酸甲酯(5.54%)和(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸(15.63%)，表明稻曲球产生的油状物成分中主要为脂肪烃和脂肪酸酯类物质。

表1 石油醚提取物油状物的化学成分Table 1 Chemical composition of the oily fraction from petroleum ether extract

2.2 化合物的结构鉴定

化合物1:白色膏状物(CHCl3);mp.81～86℃;ESI-MS m/z:281 ［M-H］-;1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:5.34(2H，m，H-9，H-10)，2.34(2H，t，J=15.0，7.5 Hz，H-2)，2.01(m)，1.62(2H，m)，1.30(m)，0.88(3H，t，J=13.4，6.3 Hz，H-18);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:180.30(C-1)，130.16(C-9)，129.87(C-10)，14.26(C-18)。以上数据与文献报道一致［15］，该化合物鉴定为油酸(Octadecenoic acid)。

化合物2:白色片状晶体(CHCl3);mp.78～82℃;ESI-MS m/z:561［M-H］-;1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:0.88(6H，t，J=13.4，6.4 Hz，CH3× 2)，1.25(76H，br，CH2×38)。以上数据与文献报道一致［16，17］，该化合物鉴定为正四十烷(Tetracontane)。

化合物3:无色针状晶体(CHCl3);mp.162～168℃;ESI-MS m/z 397［M+H］+;1H NMR(CDCl3，300 MHz)δ:5.57(1H，m，H-6)，5.38(1H，m，H-7)，5.17(2H，m，H-22，H-23)，3.63(1H，m，H-3)，1.04(3H，d，J=4.4 Hz，H-21)，0.95(3H，s，H-19)，0.92(3H，d，J=5.3 Hz，H-28)，0.84(3H，d，J=4.6 Hz，H-27)，0.82(3H，d，J=4.6 Hz，H-26)，0.63(3H，s，H-18);13C NMR(CDCl3，75 MHz)δ:38.4(C-1)，32.0(C-2)，70.5(C-3)，40.8(C-4)，139.8(C-5)，119.6(C-6)，116.3(C-7)，141.3(C-8)，46.3(C-9)，37.1(C-10)，21.1(C-11)，39.5(C-12)，43.3(C-13)，54.5(C-14)，28.2(C-15)，23.0(C-16)，56.0(C-17)，12.0(C-18)，16.3(C-19)，40.4(C-20)，21.6(C-21)，132.0(C-22)，135.6(C-23)，42.8(C-24)，33.1(C-25)，19.6(C-26)，19.9(C-27)，17.6(C-28)。以上数据与文献报道一致［18］，该化合物鉴定为为麦角甾-5，7，22-三烯-3-醇 (Ergosta-5，7，22-trien-3-ol)。

2.3 抗细菌活性

麦角甾-5，7，22-三烯-3-醇(3)对 4 种供试细菌表现出较强的抑制活性(表2)，其中对黄瓜角斑病菌的抑制活性最强，MIC值和IC50值分别为30.0 μg/mL和25.70 μg/mL。石油醚提取物油状物仅对枯草芽孢杆菌表现出弱的抑制活性，MIC值和IC50值分别为 150.0 μg/mL 和 148.29 μg/mL。油酸(1)和正四十烷(2)未检测出抗细菌活性。

表2 麦角甾-5，7，22-三烯-3-醇和油状物的抗细菌活性Table 2 Antibacterial activity of ergosta-5，7，22-trien-3β-ol and the oily fraction

2.4 抗氧化活性

采用螯合铁离子的能力来评价样品的抗氧化活性，油酸(1)和正四十烷(2)以及油状物均表现出一定的螯合亚铁离子能力(表3)，其EC50值分别为74.82 μg/mL、23.58 μg/mL 和 37.88 μg/mL，以正四十烷的螯合能力最强。麦角甾-5，7，22-三烯-3-醇(3)未检测出螯合亚铁离子的活性。

表3 化合物对Fe2+的螯合能力Table 3 Fe2+chelating activity of components

3 讨论

稻曲球主要由稻曲病菌的厚垣孢子和菌丝组成，本研究结果表明稻曲球能产生多种脂肪烃和脂肪酸酯类化合物，这些化合物在稻曲病菌致病过程中的生理生态功能值得深入研究。稻曲球中的脂溶性成分具有一定的抗菌和抗氧化活性，提示稻曲球除用于制备稻曲菌素(一类具有应用潜力的抗肿瘤活性成分［5-7］)外，还可用于制备脂溶性活性成分，这为稻曲球活性成分的开发与利用提供了依据。本论文是首次对稻曲球中脂溶性成分及其生物活性的报道。稻曲球其他成分的分离纯化与结构鉴定及生物活性评价正在进行之中。

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