发酵辅助提取对三七总皂苷提取物生物活性的影响

杨婧娟，于海宁，林秋生，沈生荣*

1浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州 310058;2浙江工业大学药学院，杭州 310014

三七是五加科人参属植物，拉丁学名为Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen，具有散瘀止血、消肿定痛之功效，是传统的名贵中药材。三七根中主要的有效成分是达玛烷型人参皂苷 Rb1、Rg1、Rd、Re和三七特有皂苷R1，以及少量的人参皂苷Rg2、Rh1等20多种皂苷成分。现代药理学研究发现［1］，三七总皂苷和其中的部分单体皂苷在血液、心脑血管及神经系统、物质代谢、抗炎、抗氧化及抗肿瘤等方面均有较好的活性。

但是，天然人参皂苷的分子结构并不是活性最佳状态，其生物活性依赖于配基上的侧链结构，糖链的数目及其与配基结合的位置。代谢研究表明，人参皂苷经口服后［2］，在体内逐级代谢为次级苷，最后代谢为苷元，这些次级苷和苷元作为人参稀有皂苷才是在体内真正发挥药理作用的物质。抗肿瘤活性的构效关系研究也表明:低糖链的皂苷及苷元具有较强的抗肿瘤作用［3］。

本研究利用微生物发酵三七，通过微生物产生丰富酶系协同作用，破坏三七根组织细胞壁致密结构，使三七皂苷溶出增加，在有效成分暴露后，糖苷酶进一步水解部分皂苷配基上的糖链，转化成活性更高的低糖链稀有皂苷。如此，发酵提取使有效成分溶出增加，同时，由于生物转化的作用使总皂苷中稀有皂苷成分也相应增加，势必会对三七总皂苷的生物活性造成一定影响。以抗氧化、抑菌活性为指标，通过对比发酵提取与常规法提取所得三七总皂苷提取物的活性差异，探讨发酵后总皂苷及其组分含量的变化，与活性增强之间的关系，为微生物发酵辅助提取法在具生物转化特性的天然产物提取新方法中的进一步应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三七药材干燥粉碎后过40目筛备用(产自云南文山，经浙江中医药大学熊耀康教授鉴定为五加科人参属植物三七的干燥根);菌种:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，B.subtilis)(浙江大学环境与资源学院农化所植物营养学实验室保藏菌种);金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus，S.aureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus，B.cereus)、大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cereviseae，S.cereviseae)、青霉菌 (Penicillium ，P.sp.)(浙江大学生工食品学院发酵所实验室保藏菌种)

主要试剂:人参皂苷标准品:人参皂苷 Rg1、Rb1、Re、Rd、Rh1、Rg3、Rh1、F1、三七皂苷 R1(纯度98%)，购自南京泽朗医药科技;DPPH、TPTZ、水溶性维生素E(Trolox)购自Sigma，山梨酸钾、苯甲酸钠购自Aladdin。

1.2 主要仪器

恒温培养箱(北京科伟永兴仪器有限公司);数控摇床(上海福玛实验设备有限公司);酶标仪(MD29SpectraMax 190，Finland);L500台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);日本岛津LC-2010A HT高效液相色谱仪。

1.3 方法

1.3.1 三七总皂苷粗提物的制备

干燥三七→粉碎→过40目筛→与辅料麸皮按7∶3比例混匀灭菌→枯草芽孢杆菌35℃固态发酵4 d→70%乙醇回流提取［4］1.5 h(固液比 1∶8，80 ℃)→离心取上清，残渣→70%乙醇回流再提取1.5 h(固液比1∶5，80℃)→离心取上清→合并两次上清，定容→浓缩成固形物，作为供试发酵提取样备用(fermentation-assisted extraction samples，FAES);另取干燥粉碎的三七粉直接进行乙醇回流提取，浓缩成固形物作为供试常规醇提样(traditional extraction samples，TES);为排除微生物发酵提取过程中，营养辅料麸皮的加入对活性测定造成干扰，以未接种微生物的三七及辅料混合培养基质同操作提取，浓缩得到的固形物作为空白对照样(control)。

1.3.2 三七总皂苷及其组分单体皂苷含量的测定

1.3.2.1 三七总皂苷的含量测定

三七皂苷的总含量测定按宋宏新等的方法［4］操作，以人参皂苷Rg1为标准品，在波长545 nm处测定吸光度值。以皂苷质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线:Y=17.16x-0.1011，R2=0.9987。取各供试样的乙醇提取液稀释至一定倍数，按标准物质测定方法操作，按下式计算样品中三七总皂苷的含量:

式中，n为测量稀释倍数，C为根据标准曲线计算所得浓度(mg/mL)，V1为测定反应体系总体积(mL)，V2为测定取用受试样液体积(mL)，V3为提取定容终体积(mL)，W为三七生药称量质量(mg)。

1.3.2.2 三七总皂苷中各组分单体皂苷的含量测定

色谱条件:色谱柱:RP18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);进样量:20 μL;流速:1 mL/min;柱温:35℃;检测波长:203 nm;流动相:水(A)-乙腈(B)，参照 Aik-Jiang Lau 等［5］方法二元梯度洗脱，0～30 min，20%B;30～60 min，20% ～45%B;60～78 min，45% ～75%B，78 ～80 min，75% ～100%B。

1.3.3 三七总皂苷提取物的抗氧化活性研究

1.3.3.1 DPPH 自由基清除法测定抗氧化能力［6］

取不同质量浓度的样液1.5 mL分别加入2.5 mL 6.5×10-5mol/L DPPH乙醇溶液中，避光反应20 min，于波长517 nm下测定吸光度值Ai;同上测定1.5 mL 50%乙醇加入2.5 mL DPPH溶液反应的吸光度AC;测定1.5 mL样液与2.5 mL 50%乙醇反应的吸光度Aj。以Trolox作为参照，实验重复3次，计算自由基清除率:清除率(%)=［1-(Ai-Aj)/Ac］×100%。

各样品对DPPH自由基的清除能力以其清除率达到50%时的作用浓度(IC50值)表示。

1.3.3.2 FRAP 法测定抗氧化能力［7］

取稀释不同浓度的样液0.1 mL，加入1.9 mL FRAP试剂(0.3 mol/L醋酸盐缓冲液、10 mmol/L TPTZ溶液及20 mmol/L FeCl3溶液按10∶1∶1的体积比混合)，37℃反应10 min，于593 nm处测吸光度值，实验重复3次。另以不同浓度的Trolox同法做标准曲线，计算三七总皂苷的Trolox当量抗氧化能力TEAC。

1.3.3.3 铁离子还原能力的测定［8］

取不同质量浓度的样液1 mL，分别加入0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.6)2.5 mL和1%铁氰化钾溶液2.5 mL，50℃水浴20 min后迅速冷却，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，3000 rpm离心10 min，取上清2.5 mL，加入蒸馏水2.5 mL及0.1%三氯化铁溶液0.5 mL，混匀后反应10 min，于波长700 nm处测定吸光度，实验重复3次。另以不同浓度的Trolox同法做标准曲线，计算三七总皂苷的Trolox当量抗氧化能力TEAC。

1.3.4 三七总皂苷提取物的抑菌活性研究［9］

1.3.4.1 指示菌悬液制备

将细菌于营养肉汤培养基中37℃培养24 h、真菌于PDB中28℃培养48 h，霉菌制成孢子悬浮液，所有受试菌均调节菌液密度至105～106CFU/mL备用。

1.3.4.2 打孔法测定三七总皂苷的抑菌活性

取100 μL制备好的菌悬液均匀涂布于含15 mL培养基的平板上，并用5 mm打孔器将涂布好菌液的平板打孔，分别加入30 mg/mL过滤除菌后的样液30 μL，并设置试剂空白(无菌水)及阳性对照(山梨酸钾、苯甲酸钠)，每个样液做3次平行。细菌于37℃恒温培养24 h，真菌于28℃恒温培养48 h。培养结束后测定培养基中抑菌圈直径。

1.3.4.3 最低抑菌浓度的测定(MIC)

取过滤除菌后的受试样液1 mL加入溶化至55℃左右的9 mL琼脂培养基中，调节控制样液在培养基中的终浓度为 1、3、5、10、15、20 mg/mL，待培养基凝固后，加入30 μL制备好的菌悬液并涂布均匀。细菌于37℃恒温培养24 h，真菌于28℃恒温培养48 h，观察菌落被完全抑制的最低样液质量浓度即为最低抑菌浓度MIC(mg/mL)。

2 结果与讨论

2.1 三七总皂苷及其组分皂苷含量测定结果

不同提取方式所得三七总皂苷及其各组分人参皂苷的含量测定结果见下表1。

表1 不同提取方式所得三七总皂苷及其组分的含量Table 1 Concentrations of total Panax notoginseng saponins and ginsenosides component extracted by different methods

发酵提取得到的三七总皂苷含量为12.25±0.21%，相比未经发酵的常规醇提含量(9.05±0.43%)，提高了 35.36%，单体成分 Rb1、Rd 等的溶出明显增加，说明微生物发酵法能有效破坏植物组织细胞壁的致密结构，利于有效成分溶出。另外，发酵提取的三七皂苷中，Rh1含量明显增多，还出现了常规醇提中未有的人参皂苷F1，而Rg1、Re、三七皂苷R1组分的含量却相对减少，推测低糖链Rh1及F1含量的增加有可能是部分Rg1、Re、R1在微生物酶作用下，其皂苷元糖链上的部分糖基被水解，发生了组分间的转化所致。空白对照含量相比常规提取略有降低，有可能是灭菌时在一定温度下，药材自身含有的酶对皂苷成分发生了微弱的分解。

2.3 发酵提取对三七总皂苷提取物抗氧化活性的影响

由图1及表2中各项抗氧化指标测定结果可知，三七总皂苷抗氧化能力对比常用的人工合成抗氧化剂Trolox相对弱，但仍显示一定的自由基清除作用及还原能力，其中发酵法提取的三七总皂苷抗氧化能力要明显优于常规醇提的皂苷。图1对于自由基DPPH的清除率，发酵提取的三七皂苷IC50值为0.377 mg/mL，与常规醇提样的 IC50(1.226 mg/mL)相比显著性降低，对照组的IC50值(1.014 mg/mL)也略有降低，说明麸皮中可能有溶出物在一定程度有清除DPPH自由基的作用，但对还原力无影响。对Fe3+离子的还原作用，发酵提取的每克干质量三七皂苷固形物中相当于Trolox的量，相比常规醇提法显著性增大，说明发酵法提取的三七皂苷对Fe3+离子的还原作用比常规醇提法强。

图1 不同提取方式所得三七总皂苷对DPPH自由基清除能力的比较Fig.1 DPPH scavenging capacity of total Panax notoginseng saponins extracted by different methods

表2 不同提取方式所得三七总皂苷的Fe3+还原能力Table 2 Fe3+reduction capability of total Panax notoginseng saponins extracted by different methods

已有的众多研究结果表明，在一定浓度范围内，活性物质的抗氧化能力是随着浓度的增大而增强。因此，在一定程度上可以解释发酵法提取的三七皂苷抗氧化能力优于常规醇提法。另外，发酵提取的三七皂苷中组分的种类及含量与常规提取法存在差异。发酵提取的二醇型皂苷 Rb1、Rd、Rg3含量较高，三醇型皂苷Rg1、Re部分转化为低糖链的Rh1、F1，这也有可能导致抗氧化能力发生变化。研究显示，糖基与三萜达玛烷环的连接部位和方式的差异可以导致抗氧化活性的不同。Liu［10］等研究发现，人参皂苷C-3位葡萄糖基的连接形式显著影响AAPH诱导溶血的抗氧化活性，Rb3和Rc的C-3位两个葡萄糖分别以1，1-及2，1-醚键结合，由于连接形式的不同，使得Rb3的IC50低于Rc。另外，各种人参皂苷和维生素E的协同抗氧化活性结果显示，各组分单独使用时并不是有效的抗氧化剂，但是Rh1、Re、R1却有显著地协同抗氧化活性。而在所有人参皂苷中，Rb1和Rb3是最重要的抗氧化组分。这些研究结果提示我们，经发酵后提取的总皂苷中各组分变化，会引起活性结构及协同作用间的变化，从而致使三七总皂苷抗氧化能力也随之发生改变。此外，也不排除发酵法提出的成分较复杂，对抗氧化能力产生了一定的影响。

2.4 发酵提取对三七总皂苷提取物抑菌活性的影响

表3 不同提取方式所得三七总皂苷对指示菌的抑菌圈直径Table 3 Diameters of inhibition zone of total Panax notoginseng saponins extracted by different methods against the indicator bacteria

注:阴性对照(无菌水)抑菌圈均无，“-”表示无抑菌效果。Potassium sorbate:山梨酸钾;Sodium benzoate:苯甲酸钠。Note:inhibition zone of negative control(sterile water)cannot detected，“-”indicate no antimicrobial activity.

表4 不同提取方式所得三七总皂苷的最低抑菌浓度Table 4 Minimum inhibitory concentration of total Panax notoginseng saponins extracted by different methods

由表3、4可以看出，发酵法提取的三七总皂苷对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌及酵母菌、青霉菌均有一定的抑制作用，且相比常规醇提法，抑菌效果更好。如常规醇提的三七总皂苷在实验浓度范围内对金黄色葡萄球菌无抑制作用，而浓度为3 mg/mL的发酵提取物即可完全抑制细菌生长。但是，两种方式提取的三七总皂苷在实验浓度范围内，对大肠杆菌均无抑制作用。

另外，按指示菌分类比较可以看出，三七总皂苷对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌等革兰氏阳性菌的抑制效果较好，对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)无抑制作用，对酵母和青霉等真菌的抑制效果也稍弱。发酵法提取的三七皂苷对腊样芽孢杆菌最低抑制浓度为1 mg/mL，而抑制青霉则达15 mg/mL。

实验结果显示，发酵法提取的三七总皂苷抑菌能力比常规醇提法强。究其原因，一方面可能是抑菌能力随皂苷含量的增大而增强，因为在相同的固形物浓度下，发酵法提取的皂苷含量相对较高，所以导致了对菌体抑制作用的增强。另一方面，发酵提取的皂苷成分变化也可能对抑菌活性造成了影响。在有关苜蓿皂苷抑菌构效关系的研究中［11］，显示糖链并不是皂苷具有抑菌活性的决定性基团，事实上，去糖基的皂苷元反而表现出更高的抑菌活性。另外，有效成分的疏水性也是抑菌活性的关键。香芹酚和百里香酚发挥抑菌功效的重要特点就是其疏水性，通过破坏菌体细胞膜结构，使其内部生命物质外泄，从而损害菌体酶系统，扰乱菌体正常代谢而造成菌体死亡。在抗菌肽分子结构与活性的关系中［12］，也显示在一定条件下，疏水性越大，其抗菌活性也就越强。人参皂苷是两性分子，达玛烷型四环三萜皂苷元是疏水基团，连接的糖链增加了其亲水性。发酵过程中，部分人参皂苷Rg1、Re及三七皂苷R1在酶的作用下，皂苷元C-20及C-6位上糖分子被部分水解，转化成了低糖链的Rh1及F1，由于皂苷配基上亲水性的糖链减少，疏水性增强，这两个组分在发酵提取的总皂苷中含量又增加，从而对抑菌活性的提高有一定的影响。

3 结论

应用微生物发酵法提取所得三七总皂苷含量比常规提取含量提高了35.36%，其中人参二醇型皂苷Rb1、Rd溶出明显增加，部分三醇型皂苷特异性的转化为稀有皂苷组分Rh1、F1。总皂苷及其组分含量的变化带来了活性的增强，使发酵提取的三七总皂苷对DPPH自由基的清除活性提高，对Fe3+离子的还原作用也比常规提取显著性增强。对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌及酵母菌、青霉菌也显示出更强的抑制活性。实验表明应用发酵法辅助提取能使有效成分溶出增加，同时能实现成分间的生物转化，进一步提高其生物活性，具有重要的实际应用价值。

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