纳米氧化锌对断奶仔猪生长性能和肠黏膜屏障的影响

胡彩虹 游兆彤 朱 康 栾兆双

(1.浙江大学饲料科学研究所，杭州 310058；2.浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，杭州 310021)

仔猪断奶后受心理、环境、营养应激等因素的影响，易产生食欲下降、消化不良、腹泻、生长受阻等，即“仔猪断奶应激综合征”，给养猪生产带来了巨大的经济损失。在断奶应激状态下仔猪肠形态和肠黏膜屏障受损是造成“仔猪断奶应激综合征”的主要原因之一［1］。锌是机体必需的微量元素，具有广泛的生理生化功能，它参与了动物机体300多种酶和功能蛋白的组成［2］。研究发现断奶仔猪饲粮中添加高锌［含2 000～3 000 mg/kg锌(氧化锌)］能降低腹泻率，促进生长［3－5］；但是大量未被吸收利用的锌随粪便排出体外，造成一定程度的锌浪费和环境污染［6－7］。寻找高剂量氧化锌的替代品一直是微量元素营养研究的热点之一。纳米氧化锌是纳米量级(1～100 nm)的新型锌源，用量少，在猪、鸡上的大量试验表明其作用效果显著［8－12］；但尚未见国内外文献报道纳米氧化锌对断奶仔猪肠黏膜屏障的影响。本试验旨在研究纳米氧化锌对断奶仔猪生长性能和肠黏膜屏障的影响，为纳米氧化锌在仔猪生产中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

氧化锌(市购，饲料级)；纳米氧化锌由浙江大学饲料科学研究所提供。经SPM－9500J3型原子力显微镜(atomic force microscope，AFM，日本岛津)接触式扫描模式在大气环境下进行成像以及AFM观察和粒径分析发现，纳米氧化锌粒径为20～80 nm，平均粒径为65 nm。纳米氧化锌的AFM图像见图1。

图1 纳米氧化锌的AFM图像Fig.1 AFM image of nano zinc oxide

1.2 试验动物及饲粮

试验动物选用“杜×长×大”断奶仔猪，参照美国NRC(1998)断奶仔猪的营养需要配合成颗粒料，基础饲粮组成及营养水平见表1。

1.3 试验设计与饲养管理

96头平均体重为(5.7±0.2)kg的21日龄“杜×长×大”断奶仔猪按胎次一致、体重相近的方法，随机分成3组:1)对照组，饲喂基础饲粮；2)氧化锌组，饲喂在基础饲粮中添加3 000 mg/kg锌(氧化锌)的试验饲粮；3)纳米氧化锌组，饲喂在基础饲粮中添加300 mg/kg锌(纳米氧化锌)的试验饲粮。每组4个重复，每个重复8头仔猪(公母各占1/2)。试验期为14 d。仔猪自由采食和饮水，从7日龄开始诱食并哺乳至21日龄断奶，按常规程序对仔猪进行免疫和饲养管理。

1.4 样品采集和指标测定

分别于28和35日龄，每组随机选取8头仔猪(每个重复2头，公母各占1/2)，肌肉注射4%戊巴比妥钠溶液(每千克体重40 mg戊巴比妥纳)进行麻醉，待麻醉完全后前腔静脉采血，肝素抗凝，制备血浆，－70℃保存。屠宰取中段空肠进行肠形态分析。宰前禁食12 h，禁食期间自由饮水。

1.4.1 生长性能

试验期内每天统计记录采食量和腹泻情况，试验结束后，禁食12 h(自由饮水)后称重，计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)、料重比(F/G)和腹泻率。腹泻率的统计方法是每天相同时间以重复为单位，记录腹泻猪头数，计算每天每个重复的腹泻率(腹泻头数/每个重复的猪总头数)和试验期内每个重复的腹泻率平均值。

1.4.2 空肠形态分析

用剪刀连续取空肠中段长度约1 cm的肠管，沿肠系膜纵向剪开，用生理盐水将其轻轻冲洗干净，平铺在滤纸上吸干液体，浸入10%的福尔马林中，4℃保存，用于光镜分析其形态结构的变化。用德国Leica组织切片设备，将肠段样品经固定、修整、冲洗、脱水、切片(厚度约5 μm)和苏木精－伊红(HE)染色制成切片；每个样品制作3个非连续性的纵切片和横切片。用Leica Qwin图像分析仪对绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度进行显微测量和分析；每张纵切片测定10个绒毛高度和隐窝深度，取其平均值作为1个测定数据。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(DM basis) %

1.4.3 血浆D－乳酸和二胺氧化酶(DAO)测定

参考胡彩虹等［13］的方法用分光光度法测定血浆中D－乳酸含量和DAO活性。

1.5 数据处理

数据以平均值±标准差表示，数据处理与分析采用SAS 6.12的一般线性模型(GLM)进行，以P＜0.05作为差异显著的判断标准。

2 结果

2.1 生长性能

纳米氧化锌对断奶仔猪生长性能的影响见表2。与对照组相比，氧化锌组和纳米氧化锌组断奶仔猪ADG分别提高了5.60%和7.26%(P＜0.05)，腹泻率降低了67.96%和70.82%(P＜0.05)；3组断奶仔猪ADFI和F/G均无显著差异(P＞0.05)，氧化锌组和纳米氧化锌组之间生长性能指标差异不显著(P＞0.05)。

2.2 空肠形态结构

纳米氧化锌对断奶仔猪空肠形态结构的影响见表3。与对照组相比，纳米氧化锌组仔猪28和35日龄绒毛高度分别提高了12.64%和10.80%(P＜0.05)；28日龄隐窝深度降低了15.42%(P＜0.05)；28和35日龄绒毛高度/隐窝深度分别提高了33.61%和17.11%(P＜0.05)。氧化锌组和纳米氧化锌组之间空肠形态结构各指标均差异不显著(P＞0.05)。

表2 纳米氧化锌对断奶仔猪生长性能的影响Table 2 Effects of nano zinc oxide on growth performance in weaner piglets(n=4)

表3 纳米氧化锌对断奶仔猪空肠形态结构的影响Table 3 Effects of nano zinc oxide on jejunum morphology in weaner piglets(n=4)

2.3 血浆D-乳酸含量和DAO活性

纳米氧化锌对断奶仔猪血浆D－乳酸含量和DAO活性的影响分别见图2和图3。与对照组相比，氧化锌组仔猪28和35日龄血浆D－乳酸含量分别降低了27.91%和19.80%(P＜0.05)，DAO活性分别降低了26.55%和26.15%(P＜0.05)。与对照组相比，纳米氧化锌组仔猪28和35日龄血浆D－乳酸含量分别降低了28.97%和20.23%(P＜0.05)，DAO活性分别降低了28.61%和24.92%(P＜0.05)。氧化锌组和纳米氧化锌组之间血浆D－乳酸含量和DAO活性均差异不显著(P＞0.05)。

图2 纳米氧化锌对断奶仔猪血浆D-乳酸含量的影响Fig.2 Effects of nano zinc oxide on plasma D－lactate content in weaner piglets

图3 纳米氧化锌对断奶仔猪血浆二胺氧化酶活性的影响Fig.3 Effects of nano zinc oxide on plasma DAO activity in weaner piglets

3 讨论

3.1 纳米氧化锌对断奶仔猪生长性能的影响

纳米氧化锌是纳米量级(1～100 nm)的新型锌源，已有大量研究报道了其对猪、鸡的作用效果［8－12］。本试验研究了饲粮中添加300 mg/kg锌(纳米氧化锌)和3 000mg/kg锌(氧化锌)对断奶仔猪生长和腹泻的影响。结果表明，与对照组相比，纳米氧化锌组断奶仔猪ADG显著提高，腹泻率显著降低，但氧化锌组和纳米氧化锌组之间差异不显著，提示纳米氧化锌的使用能节约锌的添加量，减轻高锌给环境带来的压力，这与王之盛等［8］的研究结果一致。

研究表明，纳米微粒由于粒径较小，表面积增大，与生物膜的黏着性提高，因此有利于增加微粒与肠壁的接触面积，延长接触时间，从而有利于吸收；纳米微粒口服后大量地被胃肠道派伊尔氏斑(Peyer’s Patches)的M细胞和肠上皮细胞摄取，也可通过细胞旁路途径或小肠黏膜细胞的胞饮作用而被吸收［14－15］。马恒东等［9］采用翻转肠囊法研究了仔猪小肠对纳米氧化锌的吸收，发现纳米氧化锌的吸收速率显著高于硫酸锌和普通氧化锌。另外，纳米氧化锌具有纳米粒子特有的高活性和高表面效应，其表面原子数量远高于氧化锌，具有较高的表面能、极强的电子得失能力和氧化还原性［16］，这些特性增强了纳米氧化锌与细菌的亲和力，使其通过抑制细菌电子传递链中酶活性等方式达到抗菌目的［17］。因此，纳米氧化锌的促生长和抗腹泻作用与其特殊的吸收特性和抗菌作用有关。

已有众多学者开展了纳米氧化锌的安全性研究。吴诚等［18］采用改良寇氏法以灌胃方式研究了纳米氧化锌对小白鼠的急性毒性及其病理变化，测得其半数致死量(LD50)为1 656 mg/kg。杨辉等［19］发现纳米氧化锌对小鼠胚胎成纤维细胞的损伤作用具有明显的剂量－效应关系，其半数致死浓度(24h－IC50)为 21.94 μg/mL。纳米氧化锌对动物的毒性受材料粒径、形状、添加剂量等影响。本试验中添加300 mg/kg锌(纳米氧化锌)未发现仔猪表观上的异常，但纳米氧化锌对仔猪的安全性尚需进一步研究。

3.2 纳米氧化锌对断奶仔猪肠形态的影响

锌作为肠道上皮细胞发育成熟的必需微量元素，有利于改善肠道形态，增加蛋白质合成和肠道细胞增殖［20］。本试验发现，与对照组相比，纳米氧化锌组仔猪28和35日龄绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度显著提高，而氧化锌组和纳米氧化锌组仔猪之间绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度差异不显著，说明添加氧化锌和纳米氧化锌都能保护肠黏膜屏障受损，但添加较小剂量的纳米氧化锌对肠黏膜形态就具有改善作用，其原因一方面可能是纳米氧化锌具有较强的杀菌能力，有助于维持肠道微生物区系的稳定，另一方面可能是纳米氧化锌更能促进肠道上皮细胞的发育和增殖［20］。

3.3 纳米氧化锌对断奶仔猪肠黏膜通透性的影响

DAO是人和哺乳动物小肠黏膜上层绒毛中具有高度活性的细胞内酶，其活性与黏膜细胞的核酸和蛋白合成密切相关；D－乳酸是胃肠道固有细菌的代谢终产物，哺乳动物既不产生D－乳酸，也不具备将其快速代谢分解的酶系统。血浆中D－乳酸含量和DAO活性的高低反映肠黏膜的完整性及损伤程度，是监测肠道屏障功能的重要指标。当肠黏膜受损时，D－乳酸和DAO从小肠黏膜释放入血，血液中D－乳酸含量和DAO活性升高。断奶应激引起仔猪肠黏膜屏障受损，肠道通透性增加，表现为血液中D－乳酸含量和DAO活性升高［21－22］。本试验发现，在28 和35 日龄时，纳米氧化锌组和氧化锌组仔猪血浆D－乳酸含量和DAO活性均显著低于对照组，而纳米氧化锌组与氧化锌组之间差异不显著。本研究表明，饲粮中添加纳米氧化锌和氧化锌均能抑制断奶应激造成的仔猪肠黏膜通透性的增加，保护肠黏膜屏障，饲粮中添加300 mg/kg锌(纳米氧化锌)或3 000 mg/kg锌(氧化锌)的保护效果无显著差异。有研究表明，氧化锌能抑制肠毒性大肠杆菌对肠上皮细胞的黏附和侵入，提高肠上皮细胞紧密连接的完整性，从而保护肠黏膜屏障［23］。纳米氧化锌对仔猪肠黏膜屏障具有更强的保护作用，可能是其纳米形式更有助于提高肠上皮细胞紧密连接的完整性，缓解断奶应激对仔猪肠黏膜屏障的损伤。

4 结论

①断奶仔猪饲粮中添加300 mg/kg锌(纳米氧化锌)能提高仔猪生长性能，降低腹泻率，改善肠黏膜形态和保护肠黏膜屏障。

② 饲粮中添加300 mg/kg锌(纳米氧化锌)和3 000 mg/kg锌(氧化锌)对提高断奶仔猪生长性能、降低腹泻率、改善肠黏膜形态和保护肠黏膜屏障的影响无显著差异。

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