银杏叶中黄酮和萜类内酯分离工艺条件优化

胡莉娟

我国银杏资源占世界银杏资源的3／4以上，是世界上最大的银杏生产国，但在银杏叶的开发利用研究上落后于一些发达国家，而且存在产品收率低、产品质量差等问题，造成了国有资源的极大浪费。因此，致力于这一领域的研究和开发，对现有工艺进行优化和改造，提高产品的收率和产品的质量，是一项长期坚持的任务，对促进我国的科技进步，提高产品的竞争力和经济发展有着极其重要的意义。银杏叶提取物药理作用很广泛，发挥药理作用的是其中的主要成分黄酮醇苷和萜类内酯，经研究表明，黄酮醇苷能有效地消除体内有毒的过氧自由基的作用，具有降低血脂、促进血液循环及脑部代谢；萜类内酯除具有扩张冠状动脉血管、增加血流量、改善脑营养和抗菌作用外，还具有较强的血小板活化因子抑制作用，临床应用也很广泛。多年来，针对各有效部位或有效单体成分开发的新药还比校少，本试验采用闪式硅胶柱层析法实现了银杏黄酮与萜类内酯的快速有效分离，为进一步根据其性质特点进行有针对性的分离纯化工作奠定了基础。针对其有效部位或有效成分单独开展研究，将使其药理作用和临床应用更有针对性，这样必将使其能更好的应用于临床，为人类健康做出更大的贡献。

1 实验仪器与材料

1.1 实验仪器与试药

1.1.1 实验仪器 Waters1525液相色谱仪，Waters2487紫外检测器，Waters2420蒸发散射光检测器，Empower project色谱工作站，SZ－93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.1.2 试验药剂 槲皮素、山柰素、异鼠李素、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C对照品（批号分别为100081－200406、110861－200405、110865－200404、110862－200305、110863－200505、110864－200304、110863－200307，定量测定用）均购自中国药品生物制品检定所，甲醇等为色谱纯，水为二次蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

1.2 试验材料

供试品上闪式硅胶柱前银杏叶提取物的制备：取银杏叶l kg，粉碎，用50%的乙醇回流提取，回流液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，加水溶散，滤过，上AB－8大孔树脂柱，水洗澄清后，再用4倍床体积10%乙醇洗脱，然后用8倍床体积70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，浓缩成稠浸膏，加闪式层析硅胶适量拌匀，真空干燥，即得。

2 试验方法

2.1 闪式硅胶柱分离纯化总黄酮醇苷条件优选

2.1.1 试验方法 取上述硅胶拌匀干燥后的银杏叶提取物适量加于闪式硅胶柱（Φ20mm×300 mm，填料高180mm，湿法装柱）上，分别用乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇洗脱，收集洗脱液，每一倍床体积为1份（每种溶剂收集5份），共20份。采用高效液相色谱法分别测定每份洗脱液中总黄酮醇苷含量。

2.1.2 总黄酮醇苷的含量测定方法 色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（46mm×250mm，5um）；甲醇－0.4%磷酸溶液（50∶50）为流动相；检测波长为360nm。2.1.3 对照品溶液的制备 分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品，加甲醇制成每1ml分别含0.255 2、0.250 0、0.069 2mg／ml的混合溶液，作为对照品溶液。

2.1.4 供试品溶液的制备 精密吸取每份洗脱液100ml，蒸干，残渣加甲醇－25%盐酸溶液（4：1）混合液25ml溶解，移入250ml烧瓶中，回流30min，冷却，转移至50ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.1.5 测定法 分别精密吸取对照品溶液5μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算三种黄酮醇苷元的含量，按下式核算成总黄酮醇苷的含量（表1）。

总黄酮醇苷含量＝（槲皮素含量＋山柰素含量＋异鼠李素含量）×2.51

表1 四种洗脱剂对总黄酮苷洗脱量的比较

2.1.6 结果 银杏叶总黄酮醇苷不易被乙酸乙酯洗脱，以丙酮为洗脱剂时，总黄酮醇苷基本洗脱完全，所得产物纯度较高，总黄酮醇苷回收率也较高，故选择丙酮作为洗脱剂，同时根据洗脱曲线定丙酮洗脱用量为4倍床体积。

2.2 闪式硅胶柱分离纯化萜类内酯条件优选

2.2.1 试验方法 同上述总黄酮醇苷洗脱方法，收集洗脱液，每1倍床体积为1份（预试验显示萜类内酯较易洗脱，故每种溶剂收集洗脱液3份），共12份。采用高效液相色谱法分别测定每份洗脱液中萜类内酯含量。

2.2.2 萜类内酯的测定方法 色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（46mm×250mm，5μm）；甲醇一四氢呋喃一水（25∶10∶65）为流动相；蒸发光散射检测器检测。2.2.3 对照品溶液的制备 分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C对照品，加甲醇制成每1ml分别含1.038、l.035、0.537、0.590mg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.4 供试品溶液的制备 精密吸取样品100 ml，蒸干，加水10ml超声溶散，移入分液漏斗中，滴加2%盐酸2滴，用乙酸乙酯提取4次（15、10、10、10ml），合并提取液，用5%乙酸钠溶液20 ml洗涤，分取乙酸钠液，再用乙酸乙酯10ml洗涤。合并乙酸乙酯提取液及洗液，用水洗涤2次，每次20ml，合并水洗液，用乙酸乙酯10ml洗涤，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣用甲醇溶解，定容于5ml量瓶中，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液。

2.2.5 测定法 分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，外标两点法计算样品中萜类内酯的含量（表2）。

表2 三种洗脱剂对萜类内酯洗脱量的比较

2.2.6 结果 银杏叶萜类内酯易被乙醚、乙酸乙酯洗脱，但乙醚易挥发而且不安全，故选用乙酸乙酯为洗脱剂，根据洗脱曲线定乙酸乙酯洗脱用量为3倍床体积。

3 验证与结论

取上述大孔树脂所得样品适量。平分两份。加硅胶拌匀，干燥后加于闪式硅胶柱（Φ20mm×300mm，填料高180mm，湿法装柱）上，先用乙酸乙酯3倍床体积洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，残渣用甲醇溶解并定容于25ml量瓶中，摇匀；再用丙酮4倍床体积洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，浸膏用水定容至25ml量瓶中，摇匀。采用高效液相法分别测定萜类内酯、总黄酮醇苷含量（萜类内酯含量测定供试品溶液的制备：取上述甲醇定容液5ml蒸干，然后同上法处理。总黄酮醇苷含量测定供试品溶液的制备：取上述水定液，蒸干，然后同上法处理。其它测定条件同上）

表3 闪式硅胶柱层析验证

由表3结果可知，用闪式硅胶柱层析将银杏黄酮与萜类内酯分开的同时，二者的损失均很小，故此工艺合理可行，可进行放大。

4 讨论

银杏叶提取物药理作用很广泛，临床应用也很广泛，这与其中药效成分的复杂性有关。多年来，银杏叶提取物的药理药效研究和临床应用大多是含银杏黄酮和萜类内酯的提取物，针对各有效部位或有效单体成分开发的新药还比较少，本试验采用闪式硅胶柱层析法实现了银杏黄酮与萜类内酯的快速有效分离，为进一步根据其性质特点进行有针对性的分离纯化工作奠定了基础。针对其有效部位或有效成分单独开展研究，将使其药理作用和临床应用更有针对性，这样必将使其能更好的应用于临床，为人类健康做出更大的贡献。

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