激流式生物反应器培养MDCK细胞条件优化

余彬辉，王斌卿，胡志航，朱炳林，李肖梁，方维焕

（1.浙江大学动物预防医学研究所，浙江省动物预防医学重点实验室，浙江杭州310058；2.杭州荐量兽用生物制品有限公司，浙江杭州310018）

当今病毒性疫苗多利用转瓶培养，生产工艺不仅费时费力，而且占用空间大，更重要的是病毒滴度不稳定，批次之间病毒效价差异大。随着疫苗市场的迅速发展，其生产技术将经历一场深刻的技术革新，从转瓶培养向生物反应器培养转变。这种转变符合世界生物制药发展趋势，也表明我国疫苗生产技术将逐步与国际疫苗生产技术接轨。动物细胞大规模培养在疫苗生产领域发挥着越来越重要的作用［1］。动物细胞大规模培养和表达对生产疫苗有明显的优势，一方面活性高、稳定性好，是最重要的表达系统，但动物细胞大规模培养生产疫苗还存在一定问题［2－3］，培养密度和产物浓度较低，在技术和设备上远没有原核细胞培养成熟。

目前用于动物细胞培养的生物反应器有很多种，但各具优缺点［4－5］。如常见的搅拌式生物反应器，虽然混合传气效果较好、细胞培养密度高，但高的剪切力产生大量的细胞碎片影响产物质量，而且给分离带来一定困难［6］；激流灌注式生物反应器是一种新型简便的生物反应器［7］，可用于贴壁和悬浮两种模式的细胞培养。该反应器采用一次性塑料耗材，灌注培养系统采用外循环式细胞载体灌注培养工艺，将装有纸片载体的培养袋（即灌注系统）固定于反应器外，动物细胞贴壁生长于纸片载体上，通过蠕动泵及重力作用打入培养基，实现激流系统和灌注系统的循环，培养液供给细胞正常生长代谢所需的养分，带走代谢产物；利用激流式生物反应器拖带式传气技术在线监控溶氧、p H、温度等培养条件，为细胞生长创造有利的环境，同时此部分也可单独进行悬浮细胞的培养。

本试验应用激流式生物反应器培养MDCK细胞，通过对培养基、细胞接种密度、耗糖量、溶氧量、p H和温度等参数的优化，建立MDCK细胞生物反应器规模化扩繁技术，为获得高密度细胞及在病毒疫苗生产中应用的奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和试剂 MDCK细胞，中国科学院细胞库上海生命科学院产品；MEM、DMEM、DMEM／F12培养基，Gibco公司产品；胎牛血清，杭州四季青公司产品；胰酶，上海泽衡生物公司产品；葡萄糖测定试剂盒，为上海史瑞克生物公司产品；其他试剂为国产分析纯。

1.1.2 仪器设备 分光光度计、高效液相色谱仪、倒置显微镜、AP10 4L生物反应器、溶氧电极、p H计、细胞转瓶等。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

1.2.1.1 细胞复苏 从液氮罐中取出1管MDCK细胞于37℃快速解冻后，加到含100 mL／L胎牛血清的DMEM培养基，在75 cm2细胞培养瓶中培养，4 h换液。待长成单层后PBS清洗1次，胰酶消化后以1∶4～1∶5的比率传代扩繁。

1.2.1.2 转管培养 加适量MDCK细胞和纸片载体于转管中（40 mL培养体系），采用间歇换液法培养，48 h后每12 h半数换液。

1.2.1.3 激流生物反应器培养

1.2.1.3.1 准备工作 将激流袋和灌注袋充气后检漏，气密性完好的情况下将PBS注入灌注袋浸泡纸片载体。将p H、温度和溶氧电极分别校准后装入盛有PBS缓冲液的不锈钢桶中121℃高压灭菌30 min。

1.2.1.3.2 细胞培养 安装好反应器和电极后，在AP10反应器中加4 L DMEM－HG。设定条件：纸片载体100 g，p H 7.2、溶氧量（DO）50%～60%，37℃、循环速度400 mL／min、振荡频率60 r／min，接入1.5×106个／mL MDCK细胞进行培养。

1.2.2 细胞培养条件处理 按培养基种类、p H、接种密度、DO值等参数对细胞生长的影响进行以下不同处理。

1.2.2.1 培养基 在纸片载体0.6 g、细胞接种密度2.5×105个／mL培养体系为40 mL等固定条件下，分析不同培养基（MEM、DMEM／F12、DMEMHG或DMEM－LG）对细胞生长的影响。

1.2.2.2 p H 在纸片载体0.6 g、37℃，细胞接种密度2.5×105个／mL固定条件下，分析不同p H（6.8、7.0、7.2、7.4、7.6）对细胞生长的影响。

1.2.2.3 细胞接种密度 在纸片载体 0.6 g、DMEM－HG培养基、p H 为7.2、37℃，40 mL培养体系的条件下，细胞接种密度分别为1.25×105、2.50×105、3.75×105、5.0×105、7.5×105个／mL时的生长状况。

1.2.2.4 溶氧量 纸片载体100 g、细胞接种密度1.5×106个／mL、摇床速度60 r／min、流量400 mL／min、p H7.2、37℃等固定条件下，DO分别设为20%～40%、50%～60%、70%～80%对细胞生长的影响。

1.2.2.5 液体流量和震荡频率 载纸片体100 g、细胞接种密度（1.5×106个／mL）、DO（50%～60%）、p H7.2和温度（37℃）等固定条件下，不同液体流量（200、300、400、500 mL／min）和不同振荡频率（40、60、80 r／min）培养对细胞增殖的影响。

1.2.3 细胞生长分析 将培养的细胞用PBS清洗2遍后，加入含1 g／L结晶紫的柠檬酸溶液1 L于37℃温室放置40 min揉搓摇匀后取样计数，用细胞计数板计数，计算细胞密度。

1.2.4 细胞代谢分析

1.2.4.1 葡萄糖测定 按照葡萄糖测定试剂盒说明书进行。

1.2.4.2 氨基酸测定 按照氨基酸测定试剂盒说明书进行。

1.2.4.3 纸片贴壁率计算

贴壁率（%）＝X1／X0×100%

X0代表接种时的细胞量，X1代表3h后纸片载体上的细胞贴壁数。

2 结果

2.1 不同培养基对MDCK细胞生长和代谢的影响

DMEM－HG培养MDCK细胞5 d，细胞密度达到最高（3.2×106个／mL，图1A）；采用DMEM－HG培养基，利用间歇换液法培养第6天细胞密度达到最高（3.46×106个／mL，图1B）。

图1 不同培养基对MDCK细胞生长和比生长速率的影响Fig.1 Effects of different media on cell density and specific growth rates in MDCK cells

2.2 细胞接种密度对MDCK细胞生长和代谢的影响

在载体量0.6 g、间歇换液法培养5 d的条件培养MDCK细胞，结果表明接种密度越大糖耗越高；同时糖耗高峰期也随细胞量的增大而提前，但细胞产量却不和接种密度成正比（表1）。

表1 接种密度对MDCK细胞生长的影响Table1 Effect of cell density on MDCK cell growth

2.3 p H对MDCK细胞生长的影响

图2表明，MDCK细胞在p H7.2时细胞密度最高（1.04×107个／mL），因此7.2为最适p H。

图2 p H对MDCK细胞生长的影响Fig.2 Effect of p H on MDCK cell growth

2.4 DO值、循环流量及振荡频率对MDCK细胞生长和代谢的影响

在相同条件（接种密度1.5×106个／mL、p H 7.2、37℃、培养6 d，分别固定DO值、循环流量和振荡频率进行反应器培养细胞优化试验。从图3看出，DO值50%～60%，循环流量400 mL／min和振荡频率60 r／min条件下可收获最大量细胞（17.8×106、16.4×106、18.6×106个／mL）。

2.5 激流生物反应器培养MDCK细胞

图4表明细胞在第5天达到最高耗糖量（3.1 g／L）和最高细胞密度（1.02×107个／mL）；第2天达到最大比生长速率。整个培养过程中利用气体流通开放式进行培养，因此氨浓度为零。从图4B看出，乳酸的最大浓度为28.1 mmo L／L，而氨基酸从第4天以后为零，因此在生产中根据需要补充氨基酸。

图3 DO、循环流量和振荡频率对细胞生长的影响Fig.3 Effects of DO，circulation flow and oscillation rate on cell growth

3 讨论

传统转瓶生产工艺是目前成熟的疫苗培养方法，但由于操作繁琐，传代环节多，易污染及产品质量难于控制是其大规模应用的主要障碍。激流式生物反应器采用纸片载体培养模式，纸片载体呈三维立体结构，可增加细胞黏附生长面积。该模式易于细胞生长及营养供给，培养过程可采用连续灌注培养，不断加入新鲜培养液的同时排出旧液，能有效供给营养除去代谢产物，使细胞始终处于良好的营养状态，适用于高密度细胞培养，同时延长细胞维持时间，有利于病毒的持续繁殖，提高疫苗产量［8－10］。

MDCK细胞在培养过程中需要消耗大量的糖，在糖耗完后就利用氨基酸作为碳源［11］。D／F12、MEM和DMEM－LG培养基中葡萄糖在第3天便耗完，而 DMEM－HG 在第5天 才 耗 完，因 此DMEM－HG最适于 MDCK细胞生长。代谢过程中，氨离子浓度很低，但乳酸的产量较高，因此培养到48 h进行全换液。每24 h取样检测耗糖量，根据检测情况及时补充葡萄糖和氨基酸。

本试验采用48 h后每12 h半数换液的方式，消除代谢产物给细胞带来的不利影响［11－12］。单纯从细胞培养密度出发，换液培养要比不换液高2倍，同时细胞生长对数周期短、倍增时间快，利于细胞保持良好状态，便于提前接种病毒。激流式生物反应器培养MDCK细胞，在细胞密度、扩增倍数、比生长速率等方面都明显优于转瓶培养，此外它能减少污染、节约空间和人力［13］。激流式生物反应器是靠激流供氧，因此是机械剪切力小、混合性能好的新型供氧培养系统［14］。另外，激流式反应器附有呼吸袋，因此细胞培养过程中产生的氨等不利气体通过呼吸袋排出培养系统。

图4 激流生物反应器培养MDCK细胞Fig.4 Cultivating MDCK cells in AP10 4L bioreactor

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