外源性瘦素对硫代乙酰胺致急性肝损伤保护机制的研究

黄国荣 丁忠阳 张家明

南京医科大学附属无锡市人民医院，江苏无锡 214023

肝损伤是由各种原因引起的肝脏功能的异常，严重或持续的肝损伤最终导致肝功能衰竭。临床上造成的急性肝损伤原因主要有病毒感染、服药不当、乙醇摄入过量、误服有毒食物等。目前肝损伤的防治在国内外是个严峻的课题。通过建立急性肝损伤动物模型，研究其发生机制，筛选保肝药物及其原理，具有重要的现实意义。最近研究表明，瘦素对胃，小肠、肺、肾、胰腺、心脏等器官的损伤具有保护作用[1]。但在硫代乙酰胺（Thioactitmide，TAA）所致急性肝损伤中作用如何，目前研究较少。本实验旨在探讨外源性瘦素在TAA所致急性肝损伤中的作用及机制。

1 材料及方法

1.1 主要试剂

肿瘤坏死因子α（TNF-α）放射免疫试剂盒购于北京尚柏生物医学技术有限公司。Trizol试剂购自Sigma公司。逆转录试剂盒购自上海生物科技公司。PCR引物基因序列通过GeneBank获得，设计通过Primor 5.0软件完成，上海生物工程公司合成。硫代乙酰胺院国药集团化学试剂有限公司生产。

1.2 动物分组及模型制备

36只雄性Wistar大鼠，体重230～250 g，清洁级，由吉林大学医学实验动物中心提供。大鼠分为正常组、TAA造模组及外源性瘦素预处理组，每组12只。TAA造模组予TAA 200 mg/kg腹腔注射，外源性瘦素预处理组于建立急性肝损伤模型前1 h腹腔内注射瘦素 200 mg/kg，造模步骤同TAA造模组；正常组不造模。予同等剂量0.9%氯化钠溶液腹腔注射。三组大鼠分别于造模后24 h处死。

1.3 血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和肿瘤坏死因子（TNF）水平检测

血浆标本采用Olympus AU2700生化仪测定ALT和AST浓度，TNF的检测采用放射免疫法。

1.4 核因子-κB（NF-κB）和 TNF-αmRNA 表达检测

采用RT-PCR法检测NF-κB、TNF-αmRNA表达：提取移植肝组织总RNA，取2 μL用于逆转录，反应体积为50 μL。PCR 扩增 NF-κB，TNF-αmRNA，以 β-actin作为内参照。引物由上海生工生物制品公司合成。NF-κB，TNF-α mRNA和 β-actin引 物 序 列 分 别 为 ：TNF-α 上 游 5'-CCACGCTCTTCTGTCTACTGT-3'，下游 3'-GCTACGGGCTTGTCACTC-5'，NF-κB 上游 5'-CCAGGCGGACATCATCAA-3'，下游 3'-AGGAAAGTAAACCGGAAC-5'，β -actin： 上 游 5'-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，下游 3'-CTGGAAGGTGGACAGTGAGG-5'。 反应条件为： 94℃变性 5 min， 94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 45 s， 共扩增 35 个循环，72℃延伸 10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳观察，凝胶成像系统进行扫描，进行半定量分析，以各基因与相应β-actin的PCR产物积分光密度的比值代表半定量值。

1.5 统计学方法

数据采用统计软件SPSS 13.0进行处理。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用 t检验，以 P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外源性瘦素对肝功能的影响

外源性瘦素预处理组ALT、AST水平较TAA造模组降低（P<0.01），较正常组增加，差异有高度统计学意义（P<0.01）。 见表1。

表1 造模后24 h各组小鼠ALT、AST水平比较（±s，U/L）

表1 造模后24 h各组小鼠ALT、AST水平比较（±s，U/L）

注：与外源性瘦素预处理组比较，#P<0.01

组别 只数 ALT AST正常组TAA造模组外源性瘦素预处理组12 12 12 47.1±1.7#680.0±364.7#230.2±78.2 146.3±45.2#2 580.0±649.3#980.3±234.1

2.2 各组血浆肿瘤坏死因子α水平比较

瘦素预处理组TNF-α较TAA造模组降低（P<0.01），较正常组增加，差异有高度统计学意义（P<0.01）。见表2。

表2 造模后24 h各组小鼠血浆TNF-α浓度比较（±s，ng/mL）

表2 造模后24 h各组小鼠血浆TNF-α浓度比较（±s，ng/mL）

注：与外源性瘦素预处理组比较，#P<0.01

组别 只数 TNF-α正常组TAA造模组外源性瘦素预处理组12 12 12 1.23±0.45#13.22±3.14#5.21±0.84

2.3 各组肝组织肿瘤坏死因子α、NF-κBmRNA表达变化的比较

外源性瘦素预处理组肝组织TNF-α、NF-κB mRNA表达较TAA造模组明显降低（P<0.01）；但较正常组增加，差异有高度统计学意义（P<0.01）。见表3。

3 讨论

瘦素是一种主要由脂肪组织分泌的相对分子质量为16 kDa的蛋白活性因子，含167个氨基酸，由肥胖基因ob编码，通过下丘脑内的特异受体，受神经-内分泌和能量代谢状况的反馈调节而表达。正常情况下，瘦素在脂肪组织中维持一定的水平，通过与下丘脑内的特异受体结合参与调节机体摄食、体质量平衡、新陈代谢和生育功能，还参与了机体应激后内环境稳定的过程，具有广泛的生物学意义[2]。研究发现，瘦素在急性炎症造成的组织损伤中发挥重要的作用，可能是炎症反应时细胞因子网络的组成部分[3]。

表3 造模后24h各组小鼠肝组织TNF-α、NF-κBmRNA的表达变化（±s）

表3 造模后24h各组小鼠肝组织TNF-α、NF-κBmRNA的表达变化（±s）

注：与外源性瘦素预处理组比较，#P<0.01

组别 只数 TNF-α NF-κB正常组TAA处理组外源性瘦素预处理组12 12 12 16.4±3.2#159.23±5.4#48.1±3.8 0.32±0.03#1.5±0.34#0.68±0.11

TAA所致的急性肝损伤，与人类肝损伤的特点最为接近，能较好地反映人类肝损伤的实际情况，是研究急性肝损伤发生机制最佳的动物模型[4]。NF-κB是一种能与多种细胞基因的κB位点发生特异性结合并启动基因转录的蛋白质，能够调控多种与炎性反应有关的细胞因子[5]。TNF-α作为NF-κB的下游基因，在其启动子上存在着NF-κB的结合位点。TNF-α是炎症反应中最关键的促炎性介质，在急性肝损伤病情进展中起着最关键的作用[6]。

本实验结果表明TAA处理后大鼠肝功能明显受损，而血浆TNF-α水平明显升高，与之对应的肝组织中TNF-α和NF-κB的表达明显增强，外源性瘦素预处理则各组指标明显较TAA造模组低，但较正常组高。表明外源预处理减轻TAA所致急性肝损伤的机制可能为：急性肝损伤伴发内毒素血症[7]，血浆内毒素水平升高，刺激细胞内的转录因子NF-κB，使之活化。活化后的NF-κB可增强TNF-α等炎性因子的转录，促进TNF-α生成和释放增多。引起组织内炎性细胞反复浸润及炎症反应，造成组织器官损害。瘦素作为一种抗氧化剂，对NF-κB的活化有明显的抑制作用[8]。用瘦素抑制NF-κB的活性后，直接减少了血浆及肝组织中TNF-α生成，进而减轻了肝损伤，但这种保护机制仅能部分减轻损伤，而不能完全抑制损伤。这表明TAA所致急性肝损伤是多种炎症介质参与的复杂过程，其全部机制仍待进一步研究。

本文通过外源性瘦素预处理硫代乙酰胺所致的急性肝损伤，观察其对大鼠急性肝损伤早期炎症反应的影响，探讨该作用的可能机制，深入研究其保护作用机制将有助于瘦素的应用向临床过渡。

[1]裘辉，梁华平.瘦素对损伤器官的保护作用[J].国际外科学杂志，2008，35（7）：467-470.

[2]Krol E，Speakman JR.Regulation of body mass and adiposity in the field vole，Microtus agrestis：a model of leptin resistance[J].J Endocrinol，2007，192：271-278.

[3]Shi Y，Yan GT，Lin J，et al.Intestinal ischemia-reperfusion injury made leptin decreased[J].Regul Pept ，2006，133：27-31.

[4]王春妍，范玉强，迟宝荣，等.核因子-κB在硫代乙酰胺所致急性肝损伤中的作用及机制研究[J].中华消化杂志，2008，28（11）：733-736.

[5]Puneet P，Moochhala S，Bhatia M.Chemokines in acute respiratory distress syndrome[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005，288：3-15.

[6]Nowak M，Gaines GC，Rosenberg J，et al.LPS-induced liver injury in D-galactosamine-sensitized mice requires secreted TNF-alpha and the TNF-p55 receptor [J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2000，278：1202-1209.

[7]Sukhomik I，Helou H，Lufie M，et al.The effect of leptin on intestinal recovery following ischemia-reperfusion injury in a rat[J].Pediatr Surg Int，2007，23（5）：473-478.

[8]刘立新，韩德五，任大宾.肠源性内毒素血症在硫代乙酰胺所致肝损伤发病中的作用[J].中华肝脏病杂志，2000，8（3）：174-175.