Ki－67表达及幽门螺杆菌感染在阿司匹林相关性胃黏膜病变中的作用

程艳丽，林 静，刘晋红，顾 雁，刘秀清，王亚丽，闫 伟，李玉红，张明奎

清华大学第一附属医院1.消化内科;2.病理科;3.心脏中心，北京 100016

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因之一，与胃癌发生关系密切。在H.pylori感染相关性胃炎、胃溃疡及胃癌病变中，H.pylori可诱导胃黏膜上皮细胞凋亡，并促进其增殖［1-2］。Ki-67的表达与细胞增殖密切相关，是调节细胞周期必不可少的组成部分，也是目前较为肯定的核增殖标志基因，存在于细胞周期中除G0期以外的所有阶段。Ki-67作为一个重要的细胞增殖标记［3］，在胃肠道间质瘤及胃癌组织中均有高表达，Ki-67标记指数可作为胃肠道间质瘤的预测指标，并与癌的生物学行为和预后密切相关［4-5］。但 H.pylori及 Ki-67在阿司匹林相关性胃黏膜病变中的作用尚无定论。本文通过研究Ki-67表达及H.pylori在阿司匹林相关性胃黏膜病变中的作用，以进一步揭示阿司匹林导致胃黏膜病变的相关机制，指导临床安全使用阿司匹林。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机从2008年12月－2011年1月清华大学第一附属医院消化内科及心脏中心服用阿司匹林导致相关性胃黏膜病变患者中选择病例189例，均经胃镜检查明确诊断，并排除贲门黏膜撕裂症、消化道肿瘤、食管胃底静脉曲张破裂导致出血病例，同时排除严重肝肾功能不全的患者以及1个月内有重大手术的患者。既往史中无消化道症状，如:上腹部疼痛、反酸、烧心、嗳气、恶心、呕吐、食欲减退等，共136例病例入选，年龄50～78岁，平均年龄(65.66±6.01)岁。患者服用阿司匹林剂量为75～325 mg，时间最短3 d，最长2年。

1.2 临床分组 患者在10 d内服用阿司匹林后有呕血和/或黑便症状，大便和呕吐物隐血检查阳性，就诊24 h内经胃镜检查确诊为胃和/或十二指肠溃疡或黏膜糜烂出血，定为出血组;患者服用阿司匹林后在7 d～6个月出现消化道症状，如:上腹部疼痛、反酸、烧心、嗳气、恶心、呕吐、食欲减退，就诊24～48 h内经胃镜检查确诊为胃和/或十二指肠溃疡，定为溃疡组;患者服用阿司匹林后在7 d～6个月出现消化道症状，就诊24～48 h内经胃镜检查确诊为非萎缩性胃炎伴/或不伴糜烂，萎缩性胃炎伴/或不伴糜烂，定为胃炎组;出血组患者24例，其中男16例，女8例;溃疡组患者46例，其中男28例，女18例;胃炎组患者66例，其中男44例，女22例。对照组为健康体检者正常胃黏膜排除H.pylori感染，共8例，男6例，女2例，年龄19～30岁，平均年龄(25.00±4.31)岁。所有入选病例均行快速尿素酶试验检测、病理组织学Geimsa染色及13C尿素呼气试验，以上3项指标中有2项阳性定为H.pylori感染阳性，分为H.pylori感染阳性组和阴性组，并取胃黏膜组织行Ki-67检测。

1.3 主要试剂及实验方法

1.3.1 主要试剂:兔抗人Ki-67免疫组化单克隆抗体及S-P试剂盒均购自福州迈新公司。胃幽门螺杆菌快速尿素酶诊断试剂盒、试剂购自福建三强生物化工有限公司。13C尿素呼气试验尿素胶囊试剂药盒购自原子高科股份有限公司，13C呼气质谱仪:ZHP2001型，购自北京中科科仪技术发展有限公司。

1.3.2 实验方法:(1)幽门螺杆菌检测:行胃镜检查时均在胃窦部取活组织2块，其中一块应用胃幽门螺杆菌快速尿素酶诊断试剂盒进行检测。另一块组织行病理组织学Giemsa染色;所有患者均行13C尿素呼气试验，阳性判断值:以30 min时样品中所测13C-CO2的δ‰减去零时的呼气样品的δ‰值的差表示，即检测值=δ‰(30 min)－δ‰(0 min)，阳性判断值≥4.0 ±0.4时，可判断受试者为阳性。(2)Ki-67免疫组织化学染色检测步骤:胃黏膜组织经10%的福尔马林固定，石蜡包埋，4～5 μm厚连续切片后，采用免疫组织化学染色(S-P法)检测Ki-67的表达，步骤参考试剂盒说明书操作，用已知的阳性切片作阳性对照，以 0.01 mmol/L PBS代替一抗作阴性对照。并用HE染色行常规病理组织学诊断。

1.4 H.pylori感染的诊断标准 以上3项指标中有2项阳性，判定为H.pylori感染。

1.5 胃黏膜组织中Ki-67表达水平的计算方法 用半定量法推算各检测样本Ki-67表达情况［6］，分别按以下比例记分:胃黏膜上皮组织细胞染色阳性率在0～4%记0分，5% ～24%记1分，25% ～49%记2分，50% ～74%记3分，75% ～100%记4分;染色强度阴性为0分，染色弱，但明显强于阴性对照者为1分，染色清晰者为2分，染色强者为3分。Ki-67表达水平用胃黏膜上皮组织细胞阳性率与染色强度评分的乘积来表示。

2 结果

2.1 H.pylori感染率 在阿司匹林相关性胃黏膜病变中，H.pylori感染率在出血组、溃疡组及胃炎组相比较无明显差异(P＞0.05，见表1)。

表1 阿司匹林相关性胃黏膜病变患者H.pylori感染状况Tab 1 H.pylori infection status of patients with aspirin associated gastric mucosa injury diseas

2.2 阿司匹林相关性胃黏膜病变组织中Ki-67表达情况 在正常胃黏膜上皮组织Ki-67无表达或呈弱阳性表达，平均染色积分为0.125±0.354。在阿司匹林相关性胃黏膜病变中，胃黏膜上皮组织有较强程度的表达，细胞胞质着色，呈弥漫或灶状分布。在出血组中，有58.33%(14/24)的胃黏膜上皮组织细胞胞质中呈现明显的黄色颗粒(见图1)，平均染色积分为3.916 ±1.676;在溃疡组，有 21.74%(10/46)的胃黏膜上皮组织细胞胞质中呈现明显的黄色颗粒，平均染色积分为2.174 ±1.527;在胃炎组，有12.12%(8/66)的胃黏膜上皮组织细胞胞质中呈现明显的黄色颗粒(见图2)，平均染色积分为 1.394±0.899。出血组中胃黏膜上皮组织Ki-67的表达高于溃疡组及胃炎组(P＜0.05);Ki-67的表达在任两组间总体均数差异均有统计学意义。

2.3 H.pylori感染状态与阿司匹林相关性胃黏膜病变中Ki-67表达的关系 在阿司匹林相关性胃黏膜病变中，H.pylori感染阳性率为 75.00%(102/136)。H.pylori感染阳性患者有25.49%(26/102)的胃黏膜上皮组织细胞胞质中呈现明显的黄色颗粒，平均染色积分为2.275 ±1.511;H.pylori感染阴性患者有17.65%(6/34)的胃黏膜上皮组织细胞胞质中呈现明显的黄色颗粒，平均染色积分为 1.588 ±1.698。H.pylori感染阳性患者的胃黏膜上皮组织中Ki-67阳性表达率明显高于阴性组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1 Ki-67在出血组胃黏膜上皮组织的表达(SP 100×);图2 Ki-67在胃炎组胃黏膜上皮组织的表达(SP 100×)Fig 1 Expression of Ki-67 in gastric mucosa in bleeding group(SP 100×);Fig 2 Expression of Ki-67 in gastric mucosa in gastritis group(SP 100×)

3 讨论

细胞增殖分裂受多种因素调节。在细胞周期中，细胞DNA复制合成、有丝分裂除必需有关酶系参与外，还有些蛋白质与细胞增殖密切相关，并可被相应抗体识别，被称为细胞增殖相关抗原，如增殖细胞核抗原、Ki-67、核仁组成区嗜银蛋白、statin、p53。其中，Ki-67抗原是1984年由Gerdes等［7］发现在增殖细胞中表达的一种核抗原，由分子量分别为395 KD和345 KD的双链多肽组成，由人类基因组中约3000 bp编码。由于Ki-67结构独特，缺乏与之同源的序列进行对比研究，尽管目前掌握了结构、生物学特征方面的大量资料，但其生理功能仍不清楚。大量实验研究证明Ki-67的表达与细胞增殖密切相关，是调节细胞周期必不可少的组成部分。也是目前较为肯定的核增殖标志基因，存在于细胞周期中除G0期以外的所有阶段。它开始表达于细胞周期的G1期，在S期及G2期表达增加，至M期达高峰，在分裂晚期很快消失。由于其半衰期短，脱离细胞周期后迅速降解，因此，被认为是能较可靠地全面反映细胞群体增殖活性的客观指标［8-9］，已成为目前检测肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标［7］。Ki-67在非肿瘤性胃黏膜中不表达或低表达，说明该组织增生活性较低。在胃肠道间质瘤及胃癌组织中均有高表达，Ki-67标记指数可作为胃肠道间质瘤的预测指标，并与癌的生物学行为和预后密切相关［4-5］。此外，有研究发现，非甾体类消炎药(nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs)吲哚美辛可导致大鼠胃黏膜上皮细胞增殖减少，Ki-67表达下调［10］。既往在阿司匹林诱发导致胃黏膜损伤的分子机制方面，认为阿司匹林除可直接刺激胃黏膜外，同时可通过抑制环氧化酶1(Cyclooxygenase-1，COX-1)阻断花生四烯酸代谢成前列腺素(Prostaglandins，PG)，从而抑制前列腺素的合成而致胃黏膜损伤。本实验发现，在正常胃黏膜上皮组织Ki-67无表达或呈弱阳性表达，平均积分为0.125 ±0.354，在阿司匹林导致胃黏膜病变中，出血组有58.33%(7/12)的胃黏膜上皮组织细胞胞质中呈现明显的黄色颗粒，平均积分为3.916±1.676;溃疡组有21.74%(5/23)的胃黏膜上皮组织细胞胞质中呈现明显的黄色颗粒，平均积分为2.174±1.527;胃炎组有12.12%(4/33)的胃黏膜上皮组织细胞胞质中呈现明显的黄色颗粒，平均积分为1.394±0.899。出血组中Ki-67的表达高于溃疡组及胃炎组的胃黏膜上皮组织，且差异有统计学意义(P＜0.05);说明在阿司匹林相关性胃黏膜病变中，随着胃黏膜损伤的加重，Ki-67的表达增强，细胞增殖明显，细胞增殖可能是阿司匹林相关性胃黏膜病变的发病机制之一，与黏膜损伤程度有关。

有关H.pylori对细胞增殖作用的报道不一，大多数体外试验显示H.pylori抑制细胞增殖［11-12］，但多数人体内胃黏膜细胞组织学研究显示，H.pylori可促进细胞增殖［1-2，13-15］，H.pylori感染阳性胃炎或非溃疡性消化不良患者的胃黏膜上皮细胞增殖比对照组显著增高，根除 H.pylori感染后会导致细胞增殖的降低［8］。目前研究认为，胃黏膜上皮细胞的增殖是H.pylori感染的继发性反应。H.pylori感染时炎症反应产生的细胞因子和氧自由基可能刺激胃黏膜上皮细胞的增殖;另一方面，由H.pylori感染直接导致的胃黏膜的损伤和凋亡更有可能导致胃上皮细胞的代偿性增生［16］。本研究发现，在阿司匹林相关性胃黏膜病变中，H.pylori的感染率为75.00%，其中出血组为83.33%，溃疡组为78.26%，胃炎组为69.70%，H.pylori感染率在出血组、溃疡组及胃炎组相比较无明显差异(P＞0.05)，但在出血组，H.pylori感染率仍然高于溃疡组及胃炎组，说明H.pylori感染和阿司匹林均增加了上消化道出血的危险性，两者在导致上消化道出血病变中可能起协同作用。此外，在阿司匹林相关性胃黏膜病变中，H.pylori感染阳性组的胃黏膜上皮组织Ki-67染色积分为2.275±1.511，阴性组胃黏膜上皮组织Ki-67染色积分为1.588±1.698，统计学有显著性差异(P＜0.05)。说明阿司匹林相关性胃黏膜病变组织中，胃黏膜上皮细胞增殖不仅与阿司匹林导致胃黏膜损伤有关，与H.pylori感染亦有一定关系，阿司匹林和H.pylori均参与了胃黏膜的损伤，导致了胃黏膜增殖。在临床工作中，若H.pylori感染阳性患者，服用阿司匹林治疗时，需根除H.pylori治疗，以减少胃黏膜的损伤。

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