PKH 26标记的骨髓间质干细胞在阿尔茨海默病大鼠中的迁移

李文玉，金日龙，胡兴越

PKH 26标记的骨髓间质干细胞在阿尔茨海默病大鼠中的迁移

李文玉1，金日龙2，胡兴越1

(1.浙江大学医学院邵逸夫医院神经内科，浙江杭州310016;2.浙江大学医学院附属第一医院骨科，浙江杭州310003)

目的：研究荧光染料PKH26标记的骨髓间质干细胞(bone-marrow derived mesenchymal stem cells，BM-MSC)在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，以下简称AD)大鼠中的迁移。方法：抽取正常人骨髓，体外分离培养BM-MSC;以PKH26标记第5代BM-MSC，采用流式细胞仪检测BM-MSC表面标记物，并在荧光显微镜下观察PKH26标记率;将PKH26标记的BM-MSC尾静脉注射到正常对照组和AD动物模型组，14天后在大鼠海马区，用荧光显微镜观察PKH26标记的BM-MSC细胞。利用Morris水迷宫实验比较AD模型组和BM-MSC移植组空间学习记忆能力。结果：流式细胞仪检测BM-MSC表面标记物CD73和CD105呈阳性，在体外BM-MSC的PKH26标记率达100%。Morris水迷宫实验比较BM-MSC移植组和AD动物组，BM-MSC移植组在第13、14天时空间学习记忆能力比AD动物组有显著改善。在移植BM-MSC的大鼠海马区可发现PKH26标记的BM-MSC阳性细胞，与DAPI吻合。PKH26阳性细胞在AD动物模型组明显多于正常对照组。结论：BM-MSC不仅能通过AD大鼠的血脑屏障，而且存活在AD大鼠的海马区，并有能够改善AD模型大鼠的学习障碍。

骨髓间质干细胞;骨髓细胞;阿尔茨海默病;PKH26

［JZhejiang Univ(Medical Sci)，2012，41(6):659-664.］

阿尔茨海默病痴呆(Alzheimer's disease，AD)是一组病因未明的原发性、退行性脑变性疾病。AD发病多数起病隐匿，神经元逐渐消失死亡，难于预防和阻止其恶化。目前，对于AD患者的治疗尚无特殊方法。有研究表明，人类脐带血干细胞治疗AD动物模型中发现干细胞能改善认知功能［1］，但是脐带血干细胞的临床应用存在一定的伦理上和安全性的问题，临床上很难自体移植，移植时需要用免疫抑制剂。而骨髓间质干细胞(bone-marrow derived mesenchymal stem cells，BM-MSCs)来源广泛，取材容易，体外迅速扩增，不存在伦理学问题，可运用自体移植，解除宿主可能的免疫排斥反应［1］。已研究证明，在脑血管病及神经系统退行性疾病中起到神经保护及抗炎作用［2-5］。尽管BM-MSC的移植取得了一些进展，但对BMMSC移植到AD的研究甚少，其BM-MSC能否通过血脑屏障到达AD颅内，并存活在颅内等尚有争议。本实验利用PKH26标志BM-MSC的方法，追踪BM-MSC能否到达AD大鼠颅内，探讨BM-MSC在AD大鼠颅内的分布形式及存活时间，为BM-MSC治疗AD的可能性奠定良好的研究基础。

1 材料与方法

1.1 BM-MSC培养 抽取正常人骨髓，用淋巴细胞分离液(ficoll-hypaue)密度梯度离心分离法分离单核细胞。分离的单核细胞用10%FBS(fetal bovine serum)和 含 有 1%的penicillin/streptomycin的 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle`s medium)培养，4 h后弃去未贴壁细胞，经过3～4天的休眠后迅速增殖。细胞使用0.05%胰蛋白酶和0.53 mmol/L EDTA，在37℃放置5 min从培养皿壁中分离，之后重新放入培养皿中进行传代培养，然后再分离。培养5～6代后形态趋于一致，MSCs形态呈纤维样，呈纺锤状，可形成均匀的集落。用流式细胞仪鉴定MSCs表面标志物，细胞表面蛋白如CD105和CD73呈阳性，而CD34和CD45标记则呈阴性。

1.2 PKH26标记BM-MSC 取生长状态良好的第5代BM-MSC，以0.25% 胰蛋白酶消化制成单细胞悬液。离心、洗涤细胞，加0.5 ml稀释剂C重悬细胞，制备浓度为2×107个/ml的细胞悬液。按PKH26染色说明书操作。立即在离心管内配制4×10-6mol/L的PKH26染料应用液0.5 ml，将上述MSCs悬液快速加至染料中，立即用吸管混匀。25℃无菌条件下孵化5 min，期间轻柔翻转离心管以确保混匀;加1 ml FBS终止染色，混匀后25℃孵化1 min，再加2 ml含10%FBS的L-DMEM培养基稀释终止后的样品，同上法离心10 min;弃上清，转移细胞至另一离心管，用含10%FBS的L-DMEM培养基洗涤3次;重悬细胞密度为1×106个/ml，分别放入1 ml注射器，一部分放置盖玻片的培养板内培养数天。

1.3 建立AD动物模型及BM-MSC移植 30只健康SD雄性大鼠(3月龄，300 g左右)随机分为3组:正常对照组、AD模型组和BM-MSC移植组。每组各10只，标准环境下(浙江大学医学院动物试验中心)饲养1周，随机分为正常对照组和AD模型组，经1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)将实验大鼠麻醉后，立体定向仪固定头部，备皮消毒，沿颅顶中线作2 cm切口，分离骨膜暴露头骨，与前囟向后3.0 mm，中线左右各旁开2.2 mm处，用牙科钻打开颅骨，利用微量注射器垂直进针2.8 mm，将1μl溶液缓慢注入，注射时间为5 min，留针5 min。AD模型组注射聚合的 Aβ1-40(sigma，美国)1 μl，Aβ1-40使用前用无菌生理盐水稀释成10μg/μl，37℃孵育1周，使其变为聚集状态。正常对照组注入(同上)生理盐水1μl。造模后第5天开始，连续3天用水迷宫实验筛选学习记忆能力下降的大鼠，BM-MSC移植组和正常对照组尾静脉注射PKH26标记的1×106BM-MSC 1 ml，AD模型组尾静脉注射生理盐水1 ml。

1.4 Morris水迷宫实验 AD动物模型利用水迷宫实验测试空间学习记忆能力［6］，测试前1天进行进行水中适应训练。模型制备后第5天(连续3天)和BM-MSC移植后第10天(连续5天)所有组动物均进行Morris水迷宫定位航行试验，放入不锈钢圆形水池中，使其自由游泳，自动摄像系统记录大鼠寻找平台的时间(逃避潜伏期)，设定60 s为最长逃避潜伏期，60 s后自动停止记录。每只动物每天进行2次，取平均值。所有数据运用SPSS 13.0软件进行处理，两组间比较用ANOVA检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.5 免疫组化观察 进行BM-MSC移植的大鼠，14天后均予以处死。首先经大鼠心脏，用生理盐水灌注冲洗循环血液，然后用4%的多聚甲醛(paraformaldehyde)溶液进行灌注和固定。快速取出大脑，放入4%的多聚甲醛(paraformaldehyde)固定液，在4℃环境中放置12 h，然后放入30%蔗糖溶液中。使用冰冻切片方法制作冠状切片(厚度为30μm)，进行免疫组化染色。使用PBS洗涤3次切片，细胞核染色用DAPI(用PBS 1∶100稀释)放置5 min，再用PBS洗涤3次，封片后用激光共聚焦扫描显微镜下观察DAPI阳性细胞和PHK26标记的BM-MSC。

2 结果

2.1 BM-MSC培养及鉴定结果 在体外培养BM-MSC呈梭状、漩涡样生长，排列紧密。传代5～6代的BM-MSC利用流式检测均表达高水平的干细胞标记物。其CD73(平均98%，波动在97.4% ～98.8%之间)和 CD105(平均90.3%，波动在83.1% ～96.4%)表达阳性，CD34和 CD45阴性，符合其干细胞的特征性抗原表达(图1)。

图1 流式细胞仪检测BM-MSC的标记物Fig.1 Flow cytometric analysis of BM-MSC markers

2.2 Morris水迷宫实验 造模后第5天，AD模型组逃避潜伏期比对照组延长，造模后第7天的实验中，AD模型组逃避潜伏期比对照组明显延长(P＜0.05，图2a)，说明AD模型组空间学习记忆能力下降。BM-MSC移植组和AD模型组在第10天开始行水迷宫试验中，随着训练次数的增加，各组大鼠的逃避潜伏期均逐渐缩短，但模型组大鼠逃避潜伏期在第2、3、4、5日明显长于正常对照组，BM-MSC移植组逃避潜伏期在第4、5日比AD模型组明显缩短(图2b)。这表明AD模型大鼠学习获取能力受损，而BM-MSC移植能够改善AD模型大鼠的学习记忆能力。

2.3 体外标记BM-MSC细胞结果 荧光镜下，PKH26标记1天的MSCs，可见细胞膜周围均匀分布的明亮红色荧光。标记率达100%(图3)。随着时间延长，荧光逐渐进行性减弱，标记率不断下降，2周时，少数MSCs观察不到荧光。

图2 Morris水迷宫实验观察AD大鼠逃避潜伏期的变化Fig.2 The escape latency of AD rats in the Morris water maze task

2.4 PKH26标记的BM-MSC在AD大鼠中的迁移 在AD大脑海马区切面上可见PKH26标记的BM-MSC的迁移，与细胞核染色的DAPI细胞双标吻合(图4a～c)。在AD大鼠脑组织(如大脑皮质、海马、基底节区、室管膜区等)均能观察到许多被PKH26标记的BM-MSC移植细胞。在正常对照组，在海马区也能观察到PKH26标记的BM-MSC阳性细胞(图4d～f)其阳性细胞极少，与AD模型组比较有显著的差异。这表明通过尾静脉注射的MSC能在AD大鼠脑组织存活、迁移和分化。与正常对照组比较，BM-MSC不仅能通过AD大鼠的血脑屏障且主要分布在受损的海马区。

3 讨论

本研究中培养的BM-MSC经过5～6代传代，其细胞形态及性质物无明显改变，用流式细胞仪表面标志鉴定显示，干细胞的表面标志CD73和 CD105呈90%以上阳性。CD34和CD45呈阴性。本实验利用Morris水迷宫实验结果显示，AD模型组的逃避潜伏期比正常对照组明显延长，说明AD模型组大鼠学习空间能力显著下降，从而证明造模成功。AD动物移植BM-MSC 13、14天后，BM-MSC移植组逃避潜伏期比AD模型组显著缩短，这可能与BM-MSC神经保护作用有关。

移植细胞的活体示踪在干细胞的研究中起到重要的作用，PKH26是一种红色荧光染料，可通过脂肪链与细胞膜不可逆结合，可用于长期标记，不改变细胞膜重要功能表面蛋白区，在适当的标记浓度下基本不影响细胞生长，标记强度稳定，具有良好的可重复性［7-10］。应用PKH26标记BMSCs研究表明，PKH26在一定浓度范围内不影响BMSCs的生长特性及分化能力［11-12］。本研究中，体外实验结果表明，PKH26标记 BM-MSC在第1天标记率很高(100%)，随着时间的延长，荧光逐渐进行性减弱，标记率不断下降，3周时，绝大多数MSCs观察不到荧光。这可能与PKH26本身的荧光持续时间有关。

BMSCs在AD中的应用甚少，MSC是否能通过血脑屏障到达AD大鼠颅内还存在一些争议。本研究用PKH26标记BM-MSC的示踪方法，观察到在AD大鼠的海马区有大量PKH26阳性细胞，且与DAPI阳性细胞吻合，说明尾静脉注射的BM-MSC不仅能通过血脑屏障，还能存活在颅内。在正常对照组大鼠颅内虽能观察到PKH26阳性细胞，但其数量甚少，这说明AD疾病会影响海马神经元消失，损伤的神经元可能会起到趋化MSC的作用。这已在脑梗死及多系统萎缩等神经系统疾病中证明过［2-3］。移植后21天，在AD大鼠海马区仍然能观察到PKH26标记的 BM-MSC，表明 BM-MSC能在AD大鼠颅内存活到21天以上，更长时间的观察发现PKH26标记的荧光很难判断其细胞形态。这与体外观察PKH26标记的BM-MSC的荧光显示时间吻合，说明PKH26标记观察BM-MSC在颅内存活时间及分化为其他神经元细胞有一定的限制。

综上所述，应用PKH26标记BM-MSC简便易行，示踪观察发现PKH26标记细胞在AD动物颅内存活并主要分别在海马区，与正常对照组有明显差别。并且够改善AD模型大鼠的学习障碍。但其机制尚不清楚。移植的BM-MSC在AD大鼠颅内分化为神经元?还是有抗炎、神经保护作用等有待进一步研究。

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Migration of PKH26-labeled mesenchymal stem cells in rats with Alzheimer's disease

LI Wen-yu1，JIN Ri-long，HU Xing-yue1
(1.Department of Neurology，Sir Run Run Show Hospital，Zhejiang University，Hangzhou 310016，China;2.Department of Orthopedic Surgery，The First Affiliated Hospital，Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou 310016，China)

Objective:To investigate the migration of fluorescent dye PKH26-labeled BM-MSC in the Alzheimer's model rats.Methods:Normal human bone marrow extracted for isolation of BM-MSC was cultured in vitro.The 5th passaged BM-MSC was labeled with PKH26，and observed under a fluorescence microscope for PKH26 labeling efficiency，and using flow cytometry BM-MSC surface markers was checked.The PKH26 labeled BM-MSC injected into the tail vein of the normal control group and ADanimal model group，14 days after finding the PKH26-labeled BM-MSC cells in the rat hippocampus using fluorescence microscopy.Using the Morris water maze experiment comparison of AD model and BM-MSC transplantation group of spatial learning and memory ability.Results:Flow cytometry showed BM-MSC surface markers CD73 and CD105 were positive.In vitro，PKH26-labeled rate of BM-MSC was100%.The Morris water maze experiment comparison of BM-MSC transplantation group and AD group of animals，BM-MSC transplantation group at 13，14 days of spatial learning and memory ability than AD animal group had significantly improved.14 days after BM-MSCs in rat hippocampus could be found which were PKH26-positive，consistent with DAPI staining.PKH26-positive cells in animal models of AD were significantly more than those in the normal control group.Conclusion:BM-MSC in AD rats not only migrates through the blood-brain barrier，but also mainly survives in the hippocampus of AD rats，and it can improve AD rat model of learning disabilities.

Mesenchymal stem cells;Bone marrow calls;Alzheimer's Disease;PKH26

R 749.16

A

1008-9292(2012)06-0659-06

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2012.06.009

2011-12-09

2012-02-03

浙江省自然科学基金项目(Y2090184);浙江省中医药局青年基金(2006Y005).

李文玉(1978-)，女，博士，主治医师，从事神经内科工作.

胡兴越(1962-)，男，博士，主任医师，硕导，从事神经内科工作;E-mail:huxingyue2003@126.com

［责任编辑 张荣连］