不同直投式发酵剂中嗜热链球菌的全细胞蛋白电泳分析

徐爱才，马成杰，杜昭平，华宝珍

（乳业生物技术国家重点实验室，光明乳业股份有限公司技术中心，上海 200436）

不同直投式发酵剂中嗜热链球菌的全细胞蛋白电泳分析

徐爱才，马成杰，杜昭平，华宝珍

（乳业生物技术国家重点实验室，光明乳业股份有限公司技术中心，上海 200436）

利用M17选择性培养基对不同直投式发酵剂中的嗜热链球菌进行分离；对嗜热链球菌的全细胞蛋白提取的方法进行了摸索，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对不同来源的嗜热链球菌进行了全细胞蛋白电泳分析。利用软件Gel Compar 4.0对蛋白图谱进行分析，得出了7个菌株之间的遗传相似系数矩阵，结果表明，不同来源的嗜热链球菌蛋白表达图谱有一定差异，全细胞蛋白电泳分析能较清晰的分辨至同种之间不同菌株水平。

乳酸菌，全细胞蛋白电泳，聚类分析

发酵剂是酸乳生产的关键点，其一般由嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌组成。嗜热链球菌在酸乳发酵过程中产酸、胞外多糖、双乙酰、甲醛等风味物质，其在酸乳的风味方面起着重要作用。不同的嗜热链球菌菌株有着不同的酸化速度、产粘能力、抗噬菌体等特性[1-2]。目前，我国酸奶生产所使用的发酵剂多为从丹麦汉森、丹尼斯克等公司引进的直投式发酵剂（Direct Vat Set，DVS），由于优良菌株的选育、分析、组合等核心技术的缺乏，我国尚未能大规模生产和国外相同性能的DVS。前期研究工作中，刘鑫等[3]利用随机扩增多态性DNA（random amplification of polymorphic DNA，RAPD）技术研究表明，不同来源酸乳中的嗜热链球菌菌株在分子水平存在遗传异质性，RAPD、RFLP、AFLP、DGGE、rep-PCR等分子生物学技术相继应用于乳酸菌同种不同菌株间的鉴定与差异分析[4-6]。蛋白质是基因表达的产物，不同种或同种不同菌株间由于基因的差异亦能反映到所表达的蛋白质中[7-8]，因此，可以利用蛋白电泳技术建立一种直接、快速、有效的乳酸菌分析方法。嗜热链球菌为革兰氏阳性细菌，其细胞壁较厚而难以获得全细胞蛋白，国内外少有对嗜热链球菌全细胞蛋白提取方法的系统的研究报道。本文对嗜热链球菌细胞破壁方法进行了研究，并在此基础上利用SDS-PAGE对全细胞蛋白裂解液进行了分析，以期建立嗜热链球菌同种不同菌株的分析方法，为优良菌株的分析鉴定、我国DVS的研究与开发提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

822型发酵剂、YF4型发酵剂 丹麦H公司；YT型发酵剂 美国C公司；30型发酵剂、95型发酵剂 丹麦D公司；CY型发酵剂 意大利L公司；MYE型发酵剂 法国R公司，以上均在光明乳业股份有限公司技术中心保存；溶菌酶 Sigma公司；低分子量蛋白MARKER Generay公司；小牛血清白蛋白（BSA）北京普博欣生物科技有限责任公司；聚丙烯酰胺、考马斯亮蓝R-250、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸钠（SDS）、甘氨酸、溴酚蓝 Am resco公司；M 17培养基（蛋白胨5.0g，聚蛋白胨5.0g，牛肉浸膏2.5g，甘油磷酸二钠1 9g，酵母提取物5.0g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.15g，定容至1L，M 17固体培养基添加1.5%琼脂） 其他成分与M 17液体培养基相同，Merck公司。

M IR-253生化培养箱 日本SANYO公司；SA-300VF灭菌锅 德国Sturdy Industrial公司；TDL-40B离心机 上海安亭公司；CA-1480-3超净工作台 上海净化设备公司；UV2l00紫外分光光度计 尤尼柯仪器有限公司；GEL LOGICAL 200凝胶成像系统Kodak公司；Sonics超声破膜装置 美国Branson公司。

1.2 实验方法

1.2.1 嗜热链球菌的分离与纯化 各种发酵剂经适当梯度稀释后涂布于M 17平板上，37℃培养24h后挑取单菌落至M 17液体培养基中，37℃培养过夜，次日取适量菌液梯度稀释涂布于M 17培养基平板上，重复纯化几次后用12种不同糖进行糖发酵实验。4℃保存。

1.2.2 菌体处理 从保存的平板上挑取单菌落至含M 17液体培养基的试管中，37℃培养过夜，次日按2%接种量接入100m L M 17液体培养基中，37℃培养至稳定期。将所得培养液8000r/m in离心5m in，菌体用0.05mol/L的Tris-HCl（pH 6.8）重悬洗涤两次，离心弃上清后用0.05mol/L的Tris-HCl稀释至同一OD值备用。

1.2.3 蛋白浓度的测定 以小牛血清蛋白为标准蛋白制作标准曲线，按照Bradford方法测定蛋白浓度[9]。

1.2.4 超声波破碎对嗜热链球菌破壁的影响 取一定浓度的菌悬液，在冰浴条件下利用超声破细胞壁，参数设置：500W，工作5s，间歇5s，全程时间分别为5、15、30、45、60m in，结束后8000r/m in离心5m in，取上清测定不同超声破壁时间处理后上清液中的蛋白浓度。

1.2.5 不同溶菌酶浓度对嗜热链球菌破壁的影响取一定浓度的菌悬液，加入溶菌酶至终浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、4.0mg/m L，旋涡振荡器混匀，37℃酶解3h后，8000r/min离心5min，取上清测定不同溶菌酶浓度处理后上清液中的蛋白浓度，并以相同浓度的溶菌酶溶液做对照。

1.2.6 液氮研磨及液氮冻融研磨复合处理对嗜热链球菌破壁的影响 取一定浓度的菌悬液，离心，上清转移至灭菌试管中，将所得菌体转移至经灭菌处理的陶瓷研钵中，小心倒入液氮，反复研磨菌体3次，结束后利用上清对研钵进行冲洗，洗涤液8000r/m in离心5min，取上清测定液氮研磨后上清液中的蛋白浓度；同时取等量菌悬液经液氮反复冻融三次后采取同上处理，对比两种处理后上清液中的蛋白浓度。

1.2.7 全细胞蛋白电泳[10]SDS-PAGE凝胶的制备：采用12%的分离胶（pH 8.8）和5%的浓缩胶（pH 6.8）。

点样：将菌体裂解液8000r/m in离心5m in，取上清测定蛋白浓度，经适当稀释后与5倍上样缓冲液混匀煮沸5min，点样。

电泳：浓缩胶采用80V，分离胶采用120V，直至溴酚蓝迁移至离凝胶下端1cm时停止电泳。电泳结束后经染色、固定、脱色后，照相观察。

1.2.8 数据处理及聚类分析 对SDS-PAGE电泳图谱的蛋白条带进行统计，将特定位置上有蛋白条带的记为1，无条带的记为0，利用Gel Compar 4.0 software package，以UPGMA（method of unweighted pair group with mathematic averages）法生成遗传相似系数[11]。

2 结果与分析

2.1 嗜热链球菌菌株的分离纯化与鉴定

来源于不同发酵剂的菌株经过分离、纯化、镜检观察菌体形态一致后，利用溴甲酚紫做指示剂进行糖发酵实验，糖发酵实验虽然工作量大，但仍然是鉴定乳酸菌最基本最可靠的方法之一。糖发酵结果见表1，从表1可以看出，蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖发酵结果相同，菌株均为阳性，而其他糖的发酵结果都为阴性，根据《伯杰细菌鉴定手册》鉴定结果为嗜热链球菌。将从不同发酵剂中分离得到的嗜热链球菌菌株分别记为1、2、3、4、5、6、7。

表1 菌株的糖发酵实验结果Table 1 Results of differentbiochemistry testof S.thermophilus

2.2 超声破碎对嗜热链球菌破壁的影响

菌悬液经超声波破碎后离心，上清液中的可溶性蛋白浓度随超声时间变化见图1，从图1可知，超声时间在5~30m in范围内，上清液中的可溶性蛋白浓度随着超声时间的延长逐渐增大，在超声30m in时达到1.6mg/m L，但超过30min后有一定的下降趋势，可能与超声处理过程中所产生的高温对蛋白的降解或变性沉淀有关[12]。

图1 不同超声时间处理嗜热链球菌上清液中的蛋白浓度Fig.1 Effectof differentultrasonic time of protein concentration in the supernatantof S.thermophilus

2.3 不同溶菌酶浓度对嗜热链球菌破壁的影响

菌悬液经溶菌酶酶解后离心，上清液中的可溶性蛋白浓度随溶菌酶工作浓度变化见图2。从图2可知，溶菌酶浓度在0.2~1.0mg/m L范围内，随着溶菌酶工作浓度的提高，上清液中的可溶性蛋白浓度逐渐升高，由1.2mg/m L升至2.2mg/m L，酶浓度由1mg/m L升至4mg/m L时，上清液中的可溶性蛋白浓度几乎不再增加，仅从2.2mg/m L增加至2.4mg/m L，这可能与酶促反应底物饱和有关[13]。

图2 不同溶菌酶浓度处理嗜热链球菌上清液中的蛋白浓度Fig.2 Effect of different lysozyme concentration treatmentof protein concentration in the supernatantof S.thermophilus

2.4 液氮研磨及液氮冻融研磨复合处理对嗜热链球菌破壁的影响

菌体经液氮研磨后，洗涤液离心，上清液中的蛋白浓度为1.2mg/m L，而采用液氮反复冻融和液氮研磨复合处理的上清液中的蛋白浓度达到3.8mg/m L，上清液中的蛋白浓度提高2倍以上，这可能与细胞壁在反复冻融过程中由于冰晶体的不断作用，内部的化学键遭到破坏，从而再经液氮研磨时细胞壁更易破碎有关。同时，该方法与超声波破壁法和溶菌酶酶解破壁法相比，不仅上清液中的蛋白浓度有所提高，而且克服了超声波破碎过程中高温对蛋白的降解及溶菌酶酶解后溶菌酶自身对蛋白的影响，为获得嗜热链球菌全细胞蛋白的最佳方法。

图3 液氮研磨和液氮冻融研磨后上清液中的蛋白浓度Fig.3 Effectof liquid-nitrogen grinding and liquid-nitrogen grinding after frozen and thawed of protein concentration in the supernatantof S.thermophilus

2.5 蛋白图谱分析

采用SDS-PAGE方法对不同来源的嗜热链球菌全细胞蛋白进行分析，结果见图4。从图4可以看出，不同来源的嗜热链球菌蛋白图谱有一定的相似性，但不同菌株之间仍有一定的差异。利用Gel Compar 4.0 software package对蛋白图谱进行光密度分析。分析结果见表2，从表2可知，不同菌株之间的蛋白图谱相似系数都在80%以上，这说明菌株都为同一种[14-16]，这与生理生化特征鉴定结果一致。来自同一品牌的不同型号的菌株之间的蛋白图谱相似性达到90%以上，如1和4来自丹麦H公司，相似系数为91.6%，但在42.7~66.2ku处有一明显差异，3和5来自丹麦D公司，相似系数为90.9%，但在20.1~31.0ku处也有明显差异。分析结果表明全细胞蛋白电泳技术不仅能分辨出不同品牌发酵剂中同种菌株之间的差异性，而且对同一品牌中不同型号的发酵剂中同种菌株仍能进行鉴定，能够达到分辨菌株的水平。

图4 嗜热链球菌全细胞蛋白电泳图Fig.4 Whole cell protein profiles of S.thermophilus by using SDS-PAGE

表2 嗜热链球菌菌株之间的相似系数Table 2 Coefficients of similarity between each two strains of S.thermophilus

3 结论与讨论

乳酸菌以其独特的生物学性能广泛应用于乳品、医药、饲料等行业中，并呈现出前所未有的商业价值。同种、不同种菌株有着很大的生产性能差异，对于工业生产而言，优良菌株的筛选、鉴定是一项十分重要的工作。因此，一种稳定、快速的鉴定方法对优良菌种的筛选和鉴定显得尤为重要。传统的乳酸菌鉴定方法利用形态学和生理学特征的差异等进行鉴定，可以在一定程度上反映菌株的代谢能力，但是该方法不仅耗时耗力且存在着重复性差和分辨力低等缺点[17]；现代DNA分子标记技术则因不同的分析方法可能结果不完全一致而呈现一定的缺陷性[18]；而全细胞蛋白电泳技术虽能分辨至菌株水平，但还是不能单独胜任菌种的鉴定[14]。以上说明各种鉴定方法都有一定的局限性，单一的一种技术很难对乳酸菌进行准确的鉴定，只有把各种方法结合起来进行比较研究，优势互补，才会使乳酸菌的分类鉴定更为准确。

本研究利用SDS-PAGE对不同品牌发酵剂中的嗜热链球菌的全细胞蛋白的多样性进行了分析，结果表明，不同品牌发酵剂中的嗜热链球菌的蛋白图谱相似系数达到80%以上，但不同品牌发酵剂中的嗜热链球菌菌株之间存在一定的差异；而同一品牌不同型号发酵剂中的嗜热链球菌的蛋白图谱之间相似系数达到90%以上，但亦有一定的差异。不同菌株蛋白表达的差异可能与菌株的生化性能及风味存在一定的关系，后续将进一步对菌株的蛋白差异性进行分析，以期利用基因敲除技术、蛋白组学等技术，研究基因、蛋白、风味之间的关系，为优良菌株的分析鉴定以及我国DVS的研究与开发提供技术基础。

[1]Purwandari U， Shah N P， Vasiljevic T.Effects of exopolysaccharide-producing strains ofStreptococcus thermophiluson technological and rheological properties of settype yoghurt[J].InternationalDairy Journal，2007（17）：1344-1352.

[2]CERNING J.Exocellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria[J].FEMSMicrobiol Lett，1990，87：113-130.

[3]刘鑫，马成杰，杨双熙，等.市售酸乳中嗜热链球菌的分离及RAPD分析[J].食品科学，2009，30（11）：185-188.

[4]Isable L，Carmen T，Fernanda R L.Genetic typification by pulsed-field gel electrophoresis（PFGE）and random ly amplified polymorphic DNA（RAPD）of wildLactobacillus plantarumandOenococcus oeniwine strains[J].European Food Research and Technology，2008，227：547-555.

[5]Milica N，Amarela T V，Branko J，et al.Characterization of lactic acid bacteria isolated from Bukuljac，a homemade goat’s milk cheese[J].International Journal of Food Microbiology，2008，122：162-170.

[6]Belaj A，Satovic G，Cipriani L，et al.Comparative study of discriminating capacity of RAPD，AFLP and SSRmarkers and of their effectiveness in establishing genetic relationships in olive [J].Theor Appl Genet，2003，107：736-744.

[7]Leisner JJ，VancanneytM，Rusul G，et a1.Identification oflactic acid bacteriaconstituting the predominating microflora in an acid-fermented condiment（tempoyak）popular in Malaysia[J]. International Journal of Food Microbiology，2001，63：149-157.

[8]Swircicka I.Protein profile and biochemical properties ofBacillus circulansisolated from intestines of small free-living animals in Poland[J].Folia Microbiol，2001，46（2）：165-171.

[9]Bradford MM.A rapid and sensitivemethod for thequantitation ofmicrogram quantitiesofprotein utilizing theprincipleofproteindye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

[10]厉万龙.生物化学与分子生物学实验技术[M].杭州：浙江大学出版社，2000.

[11]Vandamme P，Torck U，Falsen E，et al.Whole-cell protein electrophoretic analysis ofviridans streptococci：evidence for heterogeneity among streptococcusmitis biovars[J].International Journal of Systematic Bacteriology，1998，48：117-125.

[12]黄国平，温其标，杨晓泉，等.超声波法提取玉米醇溶蛋白的研究[J].粮食加工，2002，28（10）：1-4.

[13]阚建全.食品化学[M].北京：中国科学技术出版社，2002：111-115.

[14]Apichart N，Cheeraratana C，Sasithon P，et al.SDS-PAGE analysis of whole cell protein and outer membrane protein patterns of clinical isolates ofBurkholderia pseudomallei[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2009，2（5）：14-19.

[15]G.dimov S，Stoyanova S，Kirilkov N，et al.Molecular typing oflactobacilliisolated from dry sausage“lukanka”：comparison ofwhole cell protein versus DNA-BASEDmethods[J].Biotechnol，2010（5）：598-599.

[16]Vanier L C，Jose M P，Richard R，et al.Analysis of electrophoretic whole cell protein profiles as a tool for characterization ofenterococcusspecies[J].CurrentMicrobiology，1994，28：149-153.

[17]余勃，陆兆新.AFLP技术在食品微生物研究中的应用田[J].食品与发酵工业，2002，29（3）：75-78.

[18]Fatima G，Djamal E H，Zineb B，etal.Phenotypic and whole cell protein analysis by SDS-PAGE for identification ofdominants lactic acid bacteria isolated from Algerian raw milk[J].World Journal of Dairy&Food Sciences，2009，4（1）：78-87.

Whole cell protein analysis by SDS-PAGE ofStreptococcus thermophilusisolated from different Direct Vat Set

XU Ai-cai，MA Cheng-jie，DU Zhao-ping，HUA Bao-zhen
（State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Technology Center of Bright Dairy&Food Co.，Ltd.，Shanghai200436，China）

Seven strains of Strep tococcus thermophilus were isolated from d ifferent Direct Vat Set（DVS）by using M17 agar medium.Then，the method of whole cell p rotein extracts was studied，the whole cell p rotein was analyzed by sod ium dodecyl sulfate polyacrylam ide gel electrophoresis（SDS-PAGE）.With the software of GelCom par 4.0，the p rotein sim ilarity coefficient of each two strains were obtained w ith tackled of whole cell p rotein patterns bands，the result showed that each strain had a unique and d istinguishab le whole cell p rotein p rofiles，analysised ofwhole cell p rotein p rofiles for identification could reach the levelw ithin specie of different strains.

lac tic acid bacteria；whole cellp rotein electrophoresis；c luster analysis

Q939.11+7

A

1002-0306（2012）14-0132-04

2011－12－01

徐爱才（1985-），男，硕士，研究员，主要从事乳品微生物方面的研究。

国家科技部973计划（2010CB735705）。