李玉环,张 岩,时 威
(1.日照职业技术学院食品工程学院,山东日照 276826;
2.上海海洋大学食品学院,上海 201306;
3.中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州 510300;
4.广东海洋大学,广东湛江 524088)
枯草芽孢杆菌HS18碱性蛋白酶分离纯化及其性质研究
李玉环1,张 岩2,3,时 威4
(1.日照职业技术学院食品工程学院,山东日照 276826;
2.上海海洋大学食品学院,上海 201306;
3.中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州 510300;
4.广东海洋大学,广东湛江 524088)
从合浦珠母贝肠道中分离鉴定到酶菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HS18,将枯草芽孢杆菌HS18的发酵液,经过硫酸铵盐析、DEAE-Sephadex A-50柱层析、Sephadex G-100柱层析3步纯化后得到了单一的酶蛋白,回收率为11.4%;经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得酶蛋白分子量约为31ku;该蛋白酶最适反应温度为50℃,最适pH10.0;K+及Na+对酶有明显激活作用;丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂(PMSF)能强烈抑制酶活性。表明所纯化到的蛋白酶为丝氨酸碱性蛋白酶。
合浦珠母贝,枯草芽孢杆菌HS18,碱性蛋白酶,分离纯化,酶学性质
碱性蛋白酶是在碱性pH范围内稳定且具有活性的一类酶,属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类,是一类非常重要的工业用酶。由于微生物产生的蛋白酶为胞外酶,与动植物源蛋白酶相比具有很多优点:微生物资源来源广、菌体培养简单、酶产量高、高产菌株的选育相对简单、微生物源蛋白酶价格低廉、易于实现工业化。此外碱性蛋白酶的水解能力、耐碱能力及耐热性等性能要比其它蛋白酶强且具有明显优势,因此,碱性蛋白酶研究成为蛋白酶研究的热点[1]。目前,国内外对碱性蛋白酶产生菌株的筛选主要集中在陆地微生物,而海洋微生物产碱性蛋白酶的研究却相对较少[2]。与陆地的某些生态环境相比,海洋微生物由于长期在特殊的环境中生存进化,往往能代谢生产结构新颖、活性独特的蛋白酶类[3],近年来,越来越多的科研工作者开始把目光投向海洋环境,寻找和开发新型的微生物蛋白酶资源。本研究以从我国盛产海水珍珠的海南三亚陵水海域采集的合浦珠母贝为研究对象,从其肠道内首次筛选得到具有分泌碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株,并对其产酶学性质和纯化进行初步研究,为其在食品加工以及其他行业中应用提供理论依据。
1.1 材料与仪器
枯草芽孢杆菌HS18 分离自合浦珠母贝肠道,合浦珠母贝采集自海南三亚陵水海域(3龄左右;健康珠贝,壳长8cm左右,壳宽3.5cm左右);Sephadex G-100、DEAE-Sepharose Sigma公司;标准分子质量蛋白质 上海生工生物工程服务有限公司; K2HPO4、KCl、MgSO4·7H2O,分析纯 国药集团化学试剂有限公司。
ULTRA-TURRAX® T25匀浆机 德国IKA; GENESYSTM5紫外-可见分光光度计 美国Thermo Spectronic;3K30高速冷冻离心机 德国 SIGMA; CHRIST冷冻干燥机 德国SIGMA;Mini Protean小型垂直电泳槽 德国 Bio-rad;贮酶冰箱 日本SANYO公司。
1.2 实验方法
1.2.1 枯草芽孢杆菌HS18粗酶液的制备[4]从斜面保存的枯草芽孢杆菌HS18挑取1环接种到装有20m L经1×105Pa灭菌20m in的种子培养基的50m L试管中,并在28℃下摇床培养24h,同样方法再活化一次。吸取1m L活化好的菌液,接种到装有300m L并经1×105Pa灭菌20min的产酶培养基的500m L三角瓶中,并在28℃下摇床培养48h,发酵液经8000r/min离心15min,收集上清液,即为粗酶液。
1.2.2 酶的分离纯化
1.2.2.1 硫酸铵饱和度的选择 根据硫酸铵溶液饱和度计算表[5],在粗酶液添加硫酸铵,分别使终浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%,摇匀,4℃条件下静置过夜,12000 r/min冷冻离心20m in,经缓冲液透析后测上清液和沉淀酶活力。
1.2.2.2 柱层阶分析[6]将透析脱盐后的粗酶液弃沉淀上DEAE-Sephadex A-50阴离子交换柱(15cm ×30cm),用50mmol/L pH7.2 Tris-HCl缓冲液及含不同浓度氯化钠的Tris-HCl缓冲液,进行梯度洗脱,紫外检测器在波长280nm处检测吸收峰,测定蛋白质含量和酶活力;将DEAE-Sephadex A-50得到的活性组分上Sephadex G-100柱(2.8cm×104cm)进行层析,紫外检测器在波长280nm处检测吸收峰,测定蛋白质含量和酶活力,收集酶活性峰后用70%硫酸铵溶液浓缩。收集的酶活性部进行SDS-PAGE电泳检测酶纯度及用于酶学性质的研究。
1.2.3 酶活力测定 取1m L酶液在40℃预热4m in然后加入40℃预热4m in的1m L 2%酪蛋白溶液,混合,40℃反应10m in,再加2m L 0.4mol/L三氯乙酸终止反应。从水浴中取出静止10m in后12000 r/m in离心20min,然后吸取上清液1m L加5m L 0.4mol/L碳酸钠溶液,再加 1m L Folin试剂,40℃水浴孵化15m in,冷却后于660nm处测定其OD值[7]。对照实验:先向1m L酶液中加入2m L 0.4mol/L三氯乙酸溶液,然后加入2%酪蛋白溶液。其余步骤同上。以上均重复3次,取其平均值。1m L酶液在一定温度和pH条件下,每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位,以U表示。
1.2.4 酶学性质的初步研究
1.2.4.1 酶作用的最适温度 在20、30、40、50、60、70、80℃恒温水浴条件下,将1m L酶液与1m L 2%酪蛋白溶液分别孵化10min后,按1.2.3方法分别测定蛋白酶活力。
1.2.4.2 酶作用的最适pH 用pH为2~12的缓冲液配制质量分数2%的酪素分别与以相应缓冲液稀释的酶液混合,按1.2.3方法测定蛋白酶活力。
1.2.4.3 金属离子、蛋白酶抑制剂对酶活力的影响取适当稀释的酶液,向其中分别加入用蒸馏水配制一定浓度的金属盐溶液及蛋白酶抑制剂,40℃保温60m in后,按1.2.3方法测定蛋白酶活力。以不加金属盐溶液及蛋白酶抑制剂做对照。
2.1 酶的分离纯化
2.1.1 硫酸铵饱和度的选择 由图1可知,当硫酸铵饱和度小于30%时,上清液的酶活力基本上保持不变,沉淀的相对酶活力也微乎其微,说明硫酸铵饱和度小于30%时不能盐析出蛋白或者析出的蛋白是杂蛋白,基本上不能析出目的蛋白;当硫酸铵饱和度在30%~70%时,上清液的相对酶活力迅速下降,相反沉淀的酶活力迅速上升,可知当硫酸铵饱和度在30%~70%时目的蛋白酶被逐渐盐析出来;当硫酸铵饱和度大于70%时上清液和沉淀的酶活力基本上趋于平衡,说明当硫酸铵饱和度大于70%时盐析出的蛋白基本上是杂蛋白。综上可知可以先用饱和度为30%硫酸铵盐析去除杂蛋白,然后向上清液中补加硫酸铵使饱和度达到70%进而来盐析目的蛋白,这样通过分级沉淀可以获得更好的目的蛋白提取率。
图1 蛋白酶的分级盐析Fig.1 Precipitation of protease by ammonium sulfate
2.1.2 DEAE-Sephadex A-50柱层析 由图2可知,枯草芽孢杆菌HS18培养上清液经硫酸铵分级沉淀、溶解及透析后得到的粗酶,经DEAE-Sephadex A-50柱层析,紫外检测器在波长280nm处检测得到3个吸收峰。测定3个吸收峰蛋白质含量和酶活力,可知第1个洗脱峰(9~20号管)和第 2个洗脱峰(21~35号管)基本没有酶活力,酶活力主要集中在第3个洗脱峰(44~59号管)。将活性峰洗脱液收集,用70%硫酸铵溶液沉淀浓缩,备用。
2.1.3 Sephadex G-100柱层析 由图3可知,DEAE-Sephadex A-50离子交换层析获得的活性组分,经Sephadex G-100凝胶过滤后共分离出3个峰,通过酶活检测知道第1个洗脱峰(10~23号管)是活性峰。收集活性峰,将其用70%硫酸铵溶液沉淀浓缩,以待SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
表1 枯草芽孢杆菌HS18蛋白酶的纯化Table 1 Purification of Bacillus subtilis HS18 protease
图2 DEAE-Sephadex A-50柱层析Fig.2 DEAE-Sephadex A-50 column chromatography
图3 Sephadex G-100柱层析Fig.3 Sephadex G-100 gel filtration
2.1.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳获得单一条带(见图4),这表明纯化效果较好,该酶样已达到电泳纯,根据标准蛋白计算可得该酶的分子量约为31ku。可能由于该蛋白酶具有疏水性,在5℃浓缩过程中会逐渐析出呈树叶状蛋白酶晶体。蛋白酶的分离纯化结果见表1。由表1可知,经过盐析、DEAE-Sephadex A-50柱层析、Sephadex G-100柱层析3步纯化后酶的比活力明显提高,蛋白酶样品比活力达到4960.8U/mg,回收率11.4%。
图4 纯化酶样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图Fig.4 SDS-PAGE pattern of purified protease
2.2 酶的性质
2.2.1 酶的最适反应温度 由图5可知,当温度小于50℃时,蛋白酶活力随着温度的升高,其活力呈上升趋势;当温度大于50℃时蛋白酶活力迅速下降。在40~55℃范围内蛋白酶具有较高活力,其最适反应温度为50℃。
图5 酶作用的最适温度Fig.5 The optimum temperature of protease
2.2.2 酶的最适反应pH 由图6可知,在pH10.0以下时蛋白酶相对酶活力随着pH的升高而迅速升高,当pH10.0以上时蛋白酶相对酶活力开始下降。其中蛋白酶在pH8.0~12.0时有较高的相对酶活力,蛋白酶最适pH为10.0。综上可知,该蛋白酶具有典型的碱性蛋白酶特征[8-9],与所报道的枯草芽孢杆菌蛋白酶最适pH一致[7],因此该蛋白酶属碱性蛋白酶。
图6 酶作用的最适pHFig.6 The optimum pH of protease
2.2.3 金属离子、蛋白酶抑制剂对酶活力的影响从表2可见,1mmol/L的ZnSO4、FeSO4、MgCl2可以抑制20%~45%的酶活性,说明Zn2+、Fe2+、Mg2+对酶具有较强的抑制作用;1mmol/L的NaCl和KCl可以使酶的活力显著提高,说明K+和Na+对蛋白酶活力起激活作用,能显著提高蛋白酶活力,其中K+的激活作用最强,可以使酶活性提高31%左右。初步推测,K+在酶的活性中心结构方面具有一定的功能。金属酶抑制剂EDTA对该蛋白酶基本上没有抑制作用,说明该蛋白酶基本上不含有Ca2+,表明Ca2+对该蛋白酶没有激活作用,这与1mmol/L的CaCl2的残余相对酶活力相符;丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂PMSF几乎完全抑制该蛋白酶活力,剩余酶活仅4%,推测该蛋白酶可能为丝氨酸碱性蛋白酶。
表2 金属离子、蛋白酶抑制剂对酶活力的影响Table 2 Effect of variousmetal ions and protease inhibitors on proteas activity
通过盐析、离子交换层析、凝胶过滤分离纯化了由菌种枯草芽孢杆菌HS18发酵所产的蛋白酶,经测定,纯化后蛋白酶总活力为38694U,蛋白酶比活力为4960.8U/mg,回收率为11.4%;经SDS-PAGE电泳获得单一条带,根据电泳图可知其分子质量约为31ku; K+及Na+对酶有明显激活作用;丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂(PMSF)能强烈抑制酶活性;对蛋白酶的酶学特性研究表明,蛋白酶最适反应温度为50℃,最适pH为10.0,以上结果表明所纯化到的蛋白酶可能为丝氨酸碱性蛋白酶。目前国内关于从海洋环境中分离的芽孢杆菌产该碱性蛋白酶的报道较少[1,10],结合相关报道及本研究成果,表明海洋环境芽孢杆菌所得的碱性蛋白与陆地源芽孢杆菌产碱性蛋白酶相比具有性质稳定等特点。2009年王雪梅等[10]从南海海底沉积物中分离到一株产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌,其最适酶活温度达60℃,本研究所得的碱性蛋白酶最适酶活温度达50℃,而陆地源芽孢杆菌所产的碱性蛋白酶最适酶活温度仅在40~45℃[4,11-12],这可能由于恶劣海洋的环境,往往能代谢产生性质更加稳定的蛋白酶类。本研究从海洋生物合浦珠母贝的肠道中分离得到产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌HS18,突破了以往主要从陆生动物中分离培养产碱性蛋白酶的菌株,拓展了碱性蛋白酶的原料来源。
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Separation and purification of alkaline protease and its properties from Bacillus subtilis HS18
LIYu-huan1,ZHANG Yan2,3,SH IW ei4
(1.Food Engineering College,Rizhao Polytechnic,Rizhao 276826,China;
2.College of Food Science of Shanghai Ocean University,Shanghai201306,China;
3.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Guangzhou 510300,China;
4.Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)
The p rotease p roduced by the fermentation of strain HS18,which isolated from the intestinal of Pinctada martensi and identified as Bacillus subtilis.A p rotease with high purity from the fermentation of Bacillus sub tilis HS18 was purified by p recip itation w ith ammonium sulfate,DEAE-Sephadex A-50column chromatography and Sephadex G-100 gel filtration chrom atog raphy and its recovery rate was 11.4%.The p rotease was determ ined by SDS-PAGE to have a molecular weight of 31ku.The op timal pH and tem perature of the p rotease were 10.0 and 50℃,respec tively.In add ition,this p rotease could be ac tivated by d ivalent cations such as K+and Na+and inhibited by serine-p rotease inhibitors(PMSF).All results showed that this alkaline p rotease was a serinep rotease.
Pinctada martensi;Bacillus subtilis;alkaline p rotease;separation and purification;enzymatic p roperties
TS201.3
A
1002-0306(2012)19-0187-04
2012-02-14
李玉环(1969-),女,副教授,主要从事食品生物技术、水产品加工与综合利用及水产品安全性研究。
海南省重点科技项目(ZDXM20100005);广东省科技计划项目(2011B031200009)。