提高鸭蛋蛋清蛋白凝胶强度的酰化改性工艺优化

王 玲，郑 优，陈厚荣，汪学荣,*，彭祥伟

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市畜牧科学研究院，重庆 402460)

提高鸭蛋蛋清蛋白凝胶强度的酰化改性工艺优化

王 玲1，郑 优1，陈厚荣1，汪学荣1,*，彭祥伟2

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市畜牧科学研究院，重庆 402460)

以鸭蛋蛋清蛋白为原料，通过琥珀酸酐酰基化改性以提高鸭蛋蛋清蛋白的凝胶强度。在单因素试验的基础上，选择琥珀酸酐与蛋清蛋白质的添加比例、反应温度、反应时间、反应pH值4个因素为自变量，以蛋白凝胶强度为响应值，进行中心组合试验，建立鸭蛋蛋清蛋白的凝胶强度的二次回归方程，并通过响应面(Box-Behnken)分析，得到优化组合条件。结果表明：经过修正最优工艺为琥珀酸酐与蛋清蛋白质的添加比0.118:1、反应时间35.24min、反应温度22.91℃、反应pH8.09，在此条件下鸭蛋蛋清蛋白的凝胶强度预测值为324.66N，与验证值319.56N接近，优化结果可靠。

鸭蛋蛋清蛋白；酰基化改性；凝胶强度；优化

蛋清蛋白凝胶是通过加热使适度变性的球蛋白质分子首尾聚集，形成一个有规则的蛋白质网状结构，此结构能保持大量水分。蛋清蛋白凝胶因其可包裹大量的水分及风味物质，同时可使肉糜中的水分、脂肪、蛋白质、淀粉等形成稳定均匀的体系[1]，提高产品的咀嚼性、嫩度、风味、切片稳定性等而广泛用于食品中[2]。但未改性蛋清蛋白凝胶强度弱、透明性差、一定程度上限制了其在食品行业的应用。近年来鸭蛋产量激增[3]、且营养丰富[4]，而其主要的消费途径再制蛋市场有限，商品附加值低。对于禽蛋各项应用性质的基础研究以及深加工技术的研发成为扩大其应用范围、提高商品附加值、增加农民收益、满足工业生产需要的重要壁垒。目前已有人从鸭蛋蛋黄中提取较纯的分离蛋白[5]，制作蛋黄粉[6]等，但对蛋清的研究主要集中在蛋白粉的干燥方法上[7-8]，对蛋清蛋白的改性主要集中在对蛋清蛋白乳化性能、起泡性的影响上[9-13]，很少有人研究对对其凝胶应用性能有改善作用的改性技术。作为一种新型的食品功能添加成分，因卵传铁蛋白会干扰纤维状结构的形成[14]等原因，蛋清蛋白形成凝胶的持水性、热稳定性、黏弹性、凝胶强度等有待提高，因此研究提高鸭蛋蛋清蛋白凝胶性能的酰基化技术为提高鸭蛋附加价值，发展天然添加剂，扩大鸭蛋蛋清蛋白在食品行业中的应用范围，促进我国禽蛋业健康快速发展有着重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

白壳鲜鸭蛋 重庆市购。

透析袋(14000) 上海源叶生物科技有限公司；琥珀酸酐、茚三酮 成都市科龙化工试剂厂；其他试剂均为国产分析纯。

TA.XT2i型质构仪 英国Stable Micro System公司；PB-10精密pH计 德国赛多利斯公司；DK-8D三孔电热恒温水槽 上海齐欣科学仪器有限公司；90-2型定时恒温磁力搅拌器 上海沪西分析仪器厂；721型分光光度计 上海现科仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酰化反应

工艺流程：蛋黄、蛋清分离→纱布过滤→加入琥珀酸酐→维持一定pH值→透析袋透析24h。

操作要点：室温条件下，使用漏斗将新鲜鸭蛋的蛋清与蛋黄分离，并使用大孔纱布过滤，除去蛋清中的系带杂质备用。在一定的温度下分批加入琥珀酸酐并搅拌，反应过程中用1mol/L的NaOH溶液调节pH值，一定反应时间后取出置于透析袋中透析(4℃，24h)，透析后液体取出定容至相同体积备用。

1.2.2 酰化度测定[15]

配制茚三酮溶液，采用茚三酮比色法测定蛋白质的酰基化程度。计算酰化度：

1.2.3 凝胶制备

取20g蛋清按1.2.1节方法反应后透析，取出并加水至体积为30mL。置于100mL烧杯中，用锡泊纸封好烧杯口，放入90℃的水浴锅中加热30min，取出后用流水冷却30min以上，放于4℃冰箱中过夜，形成凝胶备用。

1.2.4 凝胶质构特性测定条件[16-17]

凝胶强度用质构仪测定。质构仪操作条件：采用p0.5探头，测试前速度5.0mm/s，测试速度2.0mm/s，测试后速度2.0mm/s，将下压凝胶10mm所需力定义为凝胶强度。将制备好的凝胶取出，于室温分别测量3个点的凝胶强度，以平均值作为最终的凝胶强度值。

1.3 实验设计

1.3.1 单因素试验

选取蛋白质与琥珀酸酐的反应底物比例、反应时间、反应温度、反应pH值4个因素对酰化改性鸭蛋蛋清蛋白的酰化度以及制备凝胶的凝胶强度进行研究，以确定酰化改性对凝胶强度的作用。试验均做3个重复，按照1.2.4节方法测定凝胶强度，结果以3次测定结果的平均值表示。

1.3.2 响应面优化试验设计[18-20]

在单因素试验基础上，采用四因素三水平的Box-Behnken响应面试验设计方法，以反应底物比例、反应时间、反应温度、反应pH值为考察因素，以反应后蛋清形成凝胶的强度为指标进行优化。

1.3.3 数据统计分析

采用Design-Expert软件(Version 7.1 Stat-Ease Inc.Minneapolis，MN，USA)对响应面试验得到的数据进行线性回归和方差分析，模型及因素的显著性均通过F值考察(P＜0.05)，所有试验均做3个重复，结果以平均值表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 琥珀酸酐与蛋清蛋白添加比例对鸭蛋蛋清蛋白凝胶强度的影响

图1 反应底物比例对酰化度和凝胶强度的影响Fig.1 Effect of proportion of egg whites to succinic anhydride on acylation degree and gel strength

取20g过滤蛋清，分别分批加入0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25g/g倍比例的琥珀酸酐，于室温反应30min，过程中加入1mol/L NaOH溶液维持溶液pH8，透析并制备凝胶，测定其酰化度及质构特性见图1。该单因素试验加入酸酐比例最高为0.25g/g，远低于国内常用比例[21]，琥珀酸酐作为一种广泛应用的食品调味剂、医药原料、改性剂，其食用也较为安全，且未有食品中最大允许使用量的限制。为保证凝胶过程不受酸酐影响，本实验中多余的未反应的酸酐在透析过程中除去。由图1可看出，随着加入琥珀酸酐比例的增加，酰化度不断增加，而凝胶强度则在琥珀酸酐与蛋白质的质量比为0～0.1的范围内不断增高并达到最大值226.24；在0.1～0.3的比例范围内则不断降低。因此确定最佳反应比例为0.1左右，且此时酰化度约为75%，证明酰化反应引起了凝胶强度的变化。

2.1.2 反应时间对鸭蛋蛋清蛋白凝胶强度的影响

图2 反应时间对酰化度和凝胶强度的影响Fig.2 Effect of reaction time on acylation degree and gel strength

取20g过滤蛋清，分批加入0.1倍比例的琥珀酸酐，于室温下分别反应0、10、17、24、31、38min，过程中加入1mol/L NaOH溶液维持溶液pH8，透析、制备凝胶。由图2可看出，在反应时间为31min之前，随反应时间的延长，凝胶强度逐渐增加；反应31min之后，随时反应时间的延长，凝胶强度逐渐减少，而酰化度则缓慢增长。反应31min时凝胶强度有最大值205.58N，酰化度为与2.1.1相似的68%，依据凝胶强度，确定31min左右为最佳反应时间。

2.1.3 反应温度对鸭蛋蛋清蛋白凝胶强度的影响

图3 反应温度对酰化程度和凝胶强度的影响Fig.3 Effect of reaction temperature on acylation degree and gel strength

取20g过滤蛋清，分批加入0.1倍比例的琥珀酸酐，分别在20、25、30、35、40、45℃条件下反应31min，过程中加入1mol/L NaOH溶液维持溶液pH8，透析、制备凝胶，测定凝胶强度、酰化度。由图3可知：凝胶强度在温度在25～35℃时缓慢升高，高于35℃之后便不断下降。在35℃时达到峰值327.96N，此时酰化度依旧为70%左右，因此确定30～35℃为最佳反应温度。

2.1.4 反应pH值对鸭蛋蛋清蛋白凝胶强度的影响

图4 反应pH值对凝胶强度的影响Fig.4 Effect of reaction pH value on acylation degree and gel strength

取20g过滤蛋清，分批加入0.1倍比例的琥珀酸酐，在35℃条件下反应31min，过程中添加1mol/L NaOH和0.1mol/L的柠檬酸溶液分别维持溶液pH6、7、8、9、10，透析制备凝胶，测定结果见图4。在反应pH值低于7时，凝胶强度随着pH值的升高而升高，当pH7～10时，凝胶强度随着pH值的升高而降低。在pH7、8时有较大值，249.32和211.25，因此确定pH7～8为最佳反应pH值。且此时的酰化度为72.158%，与前面所测酰化度相似，证明一定的酰化比例可以提高凝胶强度。

2.2 响应面试验

根据单因素试验结果，设定酸酐与蛋白质反应比例(反应底物比例)为0.05～0.15g/g之间，反应温度在30～40℃之间，反应时间在24～38min之间，反应pH值在6～8之间；以酰化改性后蛋清蛋白凝胶强度为指标，采用Box-Behnken响应面设计法优化反应条件。试验因素编码和水平如表1所示，试验安排及结果如表2所示。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Factors and levels for RSM

表2 响应面分析方案及试验结果Table 2 Experimental trials of RSM and experiment results

2.2.1 二次多项式回归模型的建立

通过分析可以得到反应条件与凝胶强度之间的二次多项式模型为：

F检验反映的是回归模型的有效性，包括失拟性检验和回归方程显著性检验。方差分析(ANOVA)(表3)和模型可信度分析(表4)显示：方程复相关系数的平方R2＝0.861，说明该模型极显著(P＜0.001)；失拟项在0.05水平上不显著(P＝0.0683＞0.05)；RAdj2为0.721，说明建立的模型能够解释72.1%响应值的变化，能很好地描述凝胶强度随酰化反应条件的变化规律。因此该模型可很好地用于预测酰化反应条件对蛋清蛋白凝胶强度的影响。

表3 凝胶强度的二次响应模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model of gel strength

由表3可知：一次项中X1、X4的偏回归系数极显著，说明反应底物比例和反应pH值对酰化蛋清蛋白凝胶强度有极显著影响；二次项中X42的偏回归系数极显著水平。

表4 模型可信度分析Table 4 Reliability analysis for response surface quadratic model of gel strength

2.2.2 两因素间的交互作用分析

采用Design-Expert软件根据多元回归拟合分析处理反应底物比例、反应时间、反应温度、反应pH值4个因素对鸭蛋蛋清凝胶强度影响的响应面分析结果见图5。由图可见，响应值存在极值，可以得到预期优化结果。

图5 各两因素交互作用对凝胶强度影响的响应面分析Fig.5 Response surface plots of the interactive effects of reaction temperature and reaction pH on gel strength

2.3 酰化改性工艺回归模型的优化和验证实验

通过优化得到最佳工艺并根据实际情况修正为琥珀酸酐与蛋白质的反应比例0.118、反应时间35.24min、反应温度22.91℃、反应pH8.09。在上述响应面分析结果确定的最佳工艺条件下进行3次酰化反应验证实验，得到凝胶的平均强度为(319.56±10.13)N，与预测值324.66N基本一致，仅与预测值相差1.5709%，说明模型与试验数据拟合较好，优化结果可靠。

3 结 论

通过采用Design-Expert软件分析反应底物比例、反应时间、反应温度和反应pH值4因素对蛋清蛋白凝胶强度的影响，得到酰化改性提高鸭蛋蛋清蛋白凝胶强度工艺参数的回归方程为：Y＝255.14＋52.78X1＋8.90X2－6.43X3＋105.61117X4－0.81X1X2－2.27X1X3＋0.43X1X4－2.87X2X3＋1.41X2X4－4.10X3X4－15.07X12－20.53116X22－11.80X32－49.90X42。方差分析结果表明拟合检验极显著，决定系数达0.861，该方程能较好的预测凝胶强度随各因素变化的规律。

根据回归方程和实际情况得到最优的工艺条件为琥珀酸酐与蛋白质反应的质量比0.118:1、反应时间35.24min、反应温度22.91℃、反应pH8.09，得到蛋清蛋白凝胶强度的预测值为324.66N。在此优化条件下进行验证实验，测得蛋白凝胶的强度为(319.56±10.13)N，与预测值接近，说明该模型可以很好地预测酰化反应条件与酰化蛋清蛋白凝胶强度之间的关系，优化结果可靠。

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Optimization of Acylation Modification for Enhancing Gel Strength of Duck Egg White Protein by Response Surface Methodology

WANG Ling1，ZHENG You1，CHEN Hou-rong1，WANG Xue-rong1,*，PENG Xiang-wei2
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Chongqing Academy of Animal Science, Chongqing 402460, China)

The objective of the current study was aimed to improve gel strength of duck egg white by means of acylation modification. Based on the single factor test, the proportion of egg whites to succinic anhydride, reaction temperature, reaction time and reaction pH value were selected as independent variables, gel strength of protein as dependent variable, quadratic regression equation of gel strength of duck egg white was established through central composite test. The optimal condition was obtained by response surface methodology (RSM). Results showed that the optimum condition for the reaction was proportion of egg whites to succinic anhydride being 0.118, reaction temperature being 22.9 ℃, reaction time lasting for 35.2 min and reaction pH value being 8.1. Under this condition the gel strength of duck egg white protein achieved to 319.56 N, approaching to the predicted value, so the optimized result was reliable.

duck egg white protein；acylation modification；gel strength；optimization

TS253.1

A

1002-6630(2012)10-0039-06

2011-06-16

现代农业(水禽)产业技术体系建设专项(nycytx-45-15)；西南大学博士基金项目(09BSr07)

王玲(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为农产品加工及贮藏。E-mail：tianmishuijing@163.com

*通信作者：汪学荣(1972—)，男，副教授，博士，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：wxr13099@163.com