超高效液相色谱-串联质谱法测定10种食品中的阿维菌素类药物残留

张文娟，连庚寅，郭晓喜，杨小兰，宋 欢,*

(1.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006；2.山西出入境检验检疫局，山西 太原 030024)

超高效液相色谱-串联质谱法测定10种食品中的阿维菌素类药物残留

张文娟1，连庚寅2，郭晓喜2，杨小兰1，宋 欢2,*

(1.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006；2.山西出入境检验检疫局，山西 太原 030024)

建立以超高效液相色谱-电喷雾串联质谱同时检测10种食品中的阿维菌素类药物(包括阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、依普菌素、莫西丁克和塞拉菌素6种大环内酯类药物)残留的确证方法。样品用乙腈提取，45℃旋蒸蒸干，再用乙腈-水(1:9，V/V)溶液复溶，PEP-C18混合固相萃取柱净化，氮气吹干后用乙腈定容，超高效液相色谱-串联质谱测定，电喷雾正离子(ESI+)、多反应模式下监测；结果表明，6种药物在5～250μg/kg范围内线性良好(R2＞0.99)，3个添加水平下，6种药物的回收率在60%～99%之间，相对标准偏差为0.2%～8.9%。6种药物的定量限(RSN≥10)均达5.0μg/kg，符合痕量分析的要求。

阿维菌素类药物；固相萃取；超高效液相色谱-串联质谱

阿维菌素又称阿佛曼菌素，是土壤微生物灰色阿维链霉菌的新型发酵代谢产物[1]。其主要品种有阿维菌素(avermectin，AVM)、伊维菌素(ivermectin，IVM)、多拉菌素(doramectin，DOR)、依普菌素(eprinomectin，EP)、莫西菌素(moxidectin，MOX)、塞拉菌素(selam ectin，SEL)等[2]。阿维菌素是带双糖支链的大环内酯类化合物，是一种新型抗生素类杀虫、杀螨剂[3]。由于阿维菌素类药物具有优异的驱虫性和较高的安全性，被认为是目前最优良、应用最广泛、销量最大的一类新型、广谱、高效、安全和用量小的兽用抗内、外寄生虫药。虽然阿维菌素类药物的作用剂量较小(ng/kg级)，但是此类药物的脂溶性较高，而且具有神经毒性和发育毒素，在动物体内的残留时间较长，所以按照世界卫生组织(World Health Organization，WHO)5级分类标准，仍将其列为高毒化合物[4]。联合国粮食及农业组织/世界卫生组织(Food and Agriculture Organization/World Health Organization，FAO/WHO)规定的阿维菌素类药物在水果中的最大残留限量(maximum residue limit，MRL)为0.01～0.02mg/L[5]。美国、欧盟、食品法典委员会和中国等均制定了阿维菌素类药物的最高残留限量。日本2006年6月实施的肯定列表制度中规定阿维菌素类药物的残留限量为20μg/kg[6]。换言之，检测动物源性食品中阿维菌素类药物的残留量具有十分重要的意义。建立阿维菌素类药物残留的检测方法非常迫切。

阿维菌素分子量大，极难气化所以尚无可行的气相色谱(gas chromatography，GC)衍生化方法，无法采用GC进行分析。目前主要的检测方法有液相色谱紫外线检测法(high performance liquid chromatography ultraviolet，HPLC-UV)[7]、液相色谱荧光检测法(high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD)[8]、免疫亲和色谱技术(immunoaffinity chromatography，IAC)[9]、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)[10]、超高效液相-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography-mass spectroscopy/mass spectroscopy，UPLC-MS/MS)等[11]。由于阿维菌素分子结构中具有共轭二烯结构，在245nm波长处有强的紫外吸收，但紫外检测器的灵敏度太低，易受杂质干扰，所以HPLC-UV无法满足目前农产品阿维菌素及其有毒代谢物的残留分析要求。HPLC-FLD具有良好的检测灵敏度和选择性，但是样品处理比较复杂试验需要衍生。IAC的试验成本昂贵，ELISA重复性差。

本实验根据固相萃取(solid-phase extraction，SPE)柱洗脱特性的不同，制备了PEP、C18、两种填料混合添柱的3种SPE小柱。以水果、蔬菜、肉类、水产品为代表，建立食品中阿维菌素类药物残留的前处理方法。充分研究和掌握当前残留检测技术的新要求，并结合检测工作实际及确证检测技术，采用超高效液相色谱－电喷雾串联四极杆质谱仪(UPLC-ESI-MS/MS)检测仪器为试验条件，提供可行的检测技术，满足国内外对食品中阿维菌素类药物残留的定性、定量检测要求，建立具有科学性、实用性和可操作性的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

梨、枣、西葫芦、生菜、黄瓜、油菜、菜花、羊肉、兔肾、虾10种待测样品 市售。

乙腈、甲酸(均为色谱纯) 美国Fisher公司；无水硫酸钠、乙酸铵(均为分析纯) 天津市科密欧化学试剂有限公司；实验用水均为超纯水。农药标准品详见表1。

1.2 仪器与设备

ACQUITY UlTEA Performance LCTM超高效液相色谱仪、Quattro Premier串联四极杆质谱仪 美国Waters公司；Ultra turrax IKA T18均质器 德国IKA公司；Laborata 4003 control旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；Reacti-ThermTMHeating Module氮吹仪 美国Pierce公司；超纯水制备仪 美国Millipore公司；C18-PEP混合固相萃取柱北京中检维康技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准工作液配制

分别精密称取0.100g标准品于100mL容量瓶中，用乙腈分别配制成1g/L的标准储备液，避光保存，待用。该溶液可在0～4℃保存6个月。

1.3.2 混合标准中间工作液的配制

准确移取适量上述6个1g/L标准储备液，用乙腈稀释成1mg/L混合标准工作液，用于添加回收实验和制备标准溶液系列，4℃条件下避光保存。

1.3.3 混合标准溶液的配制

分别准确移取一定体积的混合标准中间工作液，可根据需要用流动相稀释成适当浓度的混合标准工作液。现用现配。

1.3.4 样品溶液的制备

制样：取样品500g，用组织捣碎机充分捣碎均匀，装入洁净的盛样袋内，密封，并标明标记。将试样于－18℃条件下冰箱冷冻保藏。在抽样及制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化；提取：称取绞碎后的样品5g，精确至0.01g。置于50mL的离心管中，加入2g氯化钠，再加入20mL乙腈，混匀，用均质器以15000r/min高速均质30s，另取一支离心管加入10mL乙腈，以15000r/min洗涤均质刀10s，洗液移入第一支离心管中。将第一支离心管置于离心机内，以5000r/min离心10min，把上清液在装有适量无水硫酸钠的漏斗中过滤，收集滤液到150mL旋蒸瓶中，于45℃旋转浓缩至近干。用10mL 10%乙腈复容旋蒸瓶中的残渣，得到溶解液。净化：依次用5mL乙腈，5mL纯水过柱(控制流速1～2滴/s)活化PEP-C18混合柱，将提取中得到的溶解液移入活化的PEP-C18混合柱中，然后分别用2mL 10%乙腈溶液清洗旋蒸瓶两次，两次洗液合并后移入PEP-C18混合柱，待洗液完全流出后，然后用10mL 5%乙腈溶液淋洗，弃去全部淋出液，抽干5min。最后用6mL乙腈洗脱(吹干)，并收集到试管中；检测：将收集到洗脱液的试管于50℃条件下，氮吹浓缩至干，用0.6mL乙腈溶解掺合，涡旋混合1min，过0.22μm微孔滤膜，滤液装入小瓶中供UPLC-MS/MS测定。

表1 6种阿维菌素类标准物质Table 1 Details of 6 avermectin standards used in this study

1.3.5 超高效液相色谱检测条件

色谱柱：ACQUITY UPLC®BEH C18柱(2.5mm×50mm，1.7μm)；流动相：A(乙腈+0.1%甲酸)和缓冲盐溶液B(0.1%甲酸+10mmol/L乙酸铵)；流速：0.3mL/min；进样量：10μL；柱温40℃；样品室温度10℃。洗脱方式：梯度洗脱(表2)。

表2 梯度洗脱参数Table 2 Mobile phase composition for gradient elution

表3 阿维菌素类药物的质谱条件Table 3 MS/MS conditions for 6 avermectins

离子化模式：电喷雾电离正离子模式(electrospray ionization in positive ion mode，ESI+)；质谱扫描方式：多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)；毛细管电压：3.0kV；离子源温度：110℃；二级锥孔电压：5V；锥孔反吹气：100L/h；去溶剂气(N2)温度：350℃；去溶剂气(N2)流速：500L/h。锥孔气流(N2)流速：20L/h；碰撞气压力：3.4×103mbar。6种阿维菌素类药物的质谱条件(表3)。

2 结果与分析

2.1 标准曲线、检出限与定量限

在空白样品分别添加适量标准混合液，使样品加标量分别为2.5、5、10、15、20μg/kg，与样品同步处理。以质量浓度(μ g/kg)为横坐标x、峰面积为纵坐标Y进行线性回归，测定5 μ g/kg加标空白样品6个药物定量离子信噪比，并用外推法计算检出限和定量限，结果表明，6种阿维菌素类药物残留在5～20μg/kg的浓度范围内呈较好的线性关系，其确定系数(R2)均大于0.99，满足检测的需要(表4)。

表4 6种药物的线性方程、相关系数、检出限及定量限Table 4 Linear regression equations, determination coefficients, LODs and LOQs of six avermectins

2.2 回收率与精密度

本方法选用梨、枣、西葫芦、生菜、黄瓜、油菜、菜花、羊肉、兔肾、虾1 0种食品为样品，采用添加回收法，添加混合标准溶液适量，相当于5、10μg/kg和15μg/kg添加水平，在每个浓度水平下做10个平行实验，每个基质都带一个样品空白作为对照。按1.3.4节方法提取制备后，进行回收率试验，计算其回收率和精密度，回收率实验结果见表5(表中结果已经排除样品机制对阿维菌素类药物残量的影响)。从表5可以看到，3个添加水平下，6种药物的回收率在60%～99%之间，相对标准偏差为0.2%～8.9%，可以满足实际检测工作的需求。

测定添加5μg/kg加标的空白样品，用外推法计算6种药物的定量限(RSN＝10计)，结果发现均满足RSN≥10，所以本方法的最低定量限低于国际通行最高限量规定(10μg/kg)，可以满足实际工作的需要。

表5 6种阿维菌素类药物在10种食品中的加标回收率实验结果(n=10)Tahle 5 Recovery rates of six avermectins in 10 spiked foods samples (n=10)%

2.3 净化条件的优化

本项目研究比较C18固相萃取柱、PEP固相萃取柱、PEP-C18混合固相萃取柱3种不同SPE固相萃取柱的净化效果。3种固相萃取柱的洗脱曲线见图1。

图1 洗脱曲线图Fig.1 Elution profiles of 6 avermectins on three different solid-phase extraction columns

从图1可以看出，不同填料的固相萃取柱对阿维菌素类药物的保留行为略有不同，洗脱曲线也略有不同。经比较混合填料的洗脱曲线较整齐，回收率较高，洗脱时间也比较适中。提取液过PEP-C18小柱进行净化，与PEP小柱和C18小柱相比，能更有效地净化富含可溶性固形物的植物组织样品和富含脂肪的动物组织样品，降低非极性杂质对测定结果的影响。

2.4 色谱条件的优化

本方法选择流动相时，流动相的选择除考虑阿维菌素类药物的色谱分离效果外，必须考虑组分进入质谱前离子效率，以便获得最佳的分辨率和最高的灵敏度[12]。母离子扫描显示，目标物检测离子以[M＋NH4]+形式存在的量较多，可以定量分析，流动相的选择以提高[M＋NH4]+的含量为目的[13]。有机相选择水和乙腈作为流动相，离子化效率差；用0.1%甲酸和甲醇做流动相，峰形不太理想；改用10mmol/L乙酸铵和乙腈作为流动相，离子化效果好，且峰形尖锐对称。因此0.1%甲酸＋10mmol/L乙酸铵是ESI＋测定[M＋NH4]+灵敏度最高的条件。

2.5 质谱条件的优化

阿维菌素类药物的UPLC-MS/MS分析方法中电离过程得到的大多是Z＞1的多电荷离子。一般而言，待测物首先用ESI进行分析。如果响应值低，再换用APCI源。阿维菌素类药物的响应值足以满足测定要求，因此选用ESI源进行分析。ESI－模式[M－H]－离子化效率很低，虽然可以稳定测定阿维菌素类药物的基质样品，但是灵敏度较低，不利于提高检出限。ESI＋分为[M＋Na]＋模式和[[M＋NH4]＋模式。ESI＋[M＋Na]+模式的离子化效率很高，响应值也特别高，但存在的问题是样品基质的杂质对[M＋Na]+离子的抑制效应大，样品基质的目标物因为样品中有较多杂质基质效应的影响，所以响应值比纯标品小很多，而且同一个样品重复测试响应值的衰减很快。[M＋Na]+离子化效率随着流动相含Na+条件、离子源洁净程度会很快变差，因此对测定阿维菌素类大分子药物的基质样品[M＋Na]+模式并不合适。ESI＋[M＋NH4]+模式，流动相中NH4＋的低浓度变化不会影响到仪器的测定，样品基质的离子抑制较小，痕量测定是稳定可信的。流动相缓冲液在加微量的甲酸后，使得系统环境呈弱酸性更有利于样品基质的稳定及出峰效果。ESI＋[M＋NH4]＋模式灵敏度较好[14]。

分子离子峰的强度和电离电压的大小、锥孔电压、气化温度、吹扫气流等多个因素有关。将标样分别配制成1mg/L的10mmol/L乙酸铵-乙腈(1:1)的溶液，分别通过直接进样法对上述参数进行优化，其中锥孔电压影响最大，选择分子离子峰强度最大时的锥孔电压作为最佳锥孔电压。选定全扫描最佳的条件后，通过碰撞反应进行子离子扫描，选择为定量、定性离子。继续优化碰撞能量，选择能够产生最高丰度子离子的碰撞能量做为最佳碰撞能量。阿维菌素类药物的混合标准溶液在5μg/L时的总离子流图见图2。

图2 阿维菌素类药物的混合标准溶液在5 μg/L时的总离子流图Fig.2 UPLC-MS total ion current chromatogram of a mixture of 6 avermectin standards at 5 μg L

2.6 阿维菌素类药物测定的质谱多反应检测图

加标样品上机检测6种阿维菌素类药物含量，通过全扫描方式观察总离子流图，得到母离子峰，通过碰撞反应进行子离子扫描，确定各物质分别的定量和辅助定性离子，进行质谱多反应检测(multiple reaction monitoring，MRM)。观察6种阿维菌素类药物的质谱多反应检测图(图3)。结果表明：在各离子通道中，检测响应值都在104级以上，可以达到一般情况下农、兽药检测的底限水平，满足国家相关标准的要求。

图3 阿维菌素类药物的MRM图Fig.3 UPLC-MS-MS chromatograms of avermectins in MRM mode

3 结 论

本法用乙腈均质法提取样品，用混合固相萃取柱净化，有效去除样品中基质干扰，用UPLC-MS/MS方法的M R M模式同时测定梨、枣、西葫芦、生菜、黄瓜、油菜、菜花、羊肉、兔肾、虾1 0种食品中6种阿维菌素类农药的残留与GB/T 21320—2007《动物源性食品中阿维菌素药物残留量的测定：液相色谱串联质谱法》相比，该方法中只做了4种药品在动物源中的检测，且在前处理中C18柱的洗涤液中需要加三乙胺，洗涤液淋洗后，还需再用正己烷淋洗[15]。而本方法中做了6种阿维菌素类药物在10种动、植物源性食品中的检测，淋洗液不需要加三乙胺，PEP-C18混合柱也不需要再用正己烷淋洗，可直接用乙腈洗脱。在GB/T 20748—2006《牛肝、牛肉中阿维菌素类药物残留量的测定：液相色谱-串联质谱法》中前处理采用中性氧化铝柱净化后，残渣清理不干净，还得再次溶解，超声后才可过膜[16]。而本方法中经PEP-C18混合柱净化后，无残渣，可直接氮吹，过膜，定容。可见本方法简便、快速、高效，灵敏度高，分离效果好，完全可以满足食品中阿维菌素类药物残留量的检测要求。

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Determination of Avemectin Residues in 10 Foods by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Wen-Juan1，LIAN Gen-yin2，GUO Xiao-xi2，YANG Xiao-lan1，SONG Huan2,*
(1. College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2. Shanxi Border Inspection and Quarantine Bureau, Taiyuan 030024, China)

A reliable analytical method to determine 6 avermectin residues in 10 foods was developed using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Samples were extracted with acetonitrile,evaporated in a rotary evaporator until dryness, re-dissolved in a mixture of acetonitrile and water (1:9,V/V), cleaned up on a PEPC18cartridge, blown under nitrogen gas until dryness, and then re-dissolved in acetonitrile prior to UPLC-MS/MS analysis by positive ion electrospray ionization (ESI+) in multiple reaction monitoring (MRM) mode. The calibration curves of 6 avermectins were linear in the concentration of 5 － 250 μg/kg (R2＞ 0.99). The average recovery rates at three spiked levels were 60% －99% with relative standard deviations (RSDs) of 0.2%－8.9%. The quantification limits for 6 avermectins (RSN≥10) were slightly lower than 5.0 μg/kg. This analytical method could meet the requirements for trace analysis.

abamectins；solid phase extraction；ultra-high high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

TS207.3

A

1002-6630(2012)18-0226-06

2011-07-07

国家质检总局科研项目(2008IK117)

张文娟(1982—)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：zwj1719@163.com

*通信作者：宋欢(1968—)，女，高级工程师，硕士，研究方向为食品分析化学。E-mail：huanle_song@163.com