塔克拉玛干 “沙漠人”热习服生理特性与血管紧张素转换酶基因插入/缺失和醛固酮合成酶基因启动子区C-344T多态性的相关性

曹海涛，邱长春，程祖亨，丁志坚

1南京医科大学附属常州市第二人民医院心内科，江苏常州213000

2中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所分子生物学实验室，北京100005

3新疆医科大学第一附属医院心脏中心，乌鲁木齐830000

新疆的塔克拉玛干大沙漠以“死亡之海”闻名于世，是中国第一、世界第二的大沙漠，全年降水量约14 mm，蒸发量约3000 mm，极度干旱。夏季炎热，气温可高达50～60℃。在这死亡之海的腹地，沿克里雅河下游两岸生活着一个几乎与世隔绝的游牧部落“克里雅人”。因其居住在大沙漠腹地，1958年才被中国科学院治沙队和石油重力队发现，故被称为“沙漠人”，总人口约有千余人。克里雅人群的起源问题至今未有定论，从这里居民的宗教信仰、饮食文化和人种特征看，和维吾尔族非常相似［1］。

对于新疆“沙漠人”的前期流行病学调查表明，在当地常年夏季气温高于40℃，湿度＜40%的干热环境下，这一特殊的封闭人群仍然能维持正常的生理功能，其机体的中心体温、体质指标、电解质与酸碱环境均能维持动态平衡状态，这无疑把研究热点引向了热适应生理调节过程中各个重要环节的基因调控机制上。血管紧张素转换酶 (angiotensin-converting enzyme，ACE)和醛固酮合成酶与机体水盐代谢密切相关，水盐代谢又是机体热习服中的重要环节，因此笔者认为调控这两个酶的基因多态性可能与“沙漠人”热习服有关。本研究旨在探讨塔克拉玛干“沙漠人”热习服生理特性与ACE基因插入/缺失 (insertion/deletion，I/D)和醛固酮合成酶基因(CYP11B2)启动子区C-344T多态性的关系。

对象和方法

研究对象调查时间为2005年9月7日至16日及2008年10月6日至12日，研究对象为随机抽取的新疆塔克拉玛干“沙漠人”居住地新疆和田地区于田县达里雅布依乡年龄≥16岁的“沙漠人”503名(约占“沙漠人”成年人的60.97%)，以及按年龄、性别和地区匹配原则随机抽取的新疆和田地区于田县先拜巴扎镇≥16岁的维吾尔族成年人237名 (对照组)。研究经新疆医科大学医学伦理委员会及和田地区地委的批准，所有研究对象均签署知情同意书。

问卷调查收集被研究人群的人口学资料及家族史、现病史 (高血压、糖尿病和肿瘤等)、个人史(吸烟、饮酒等)、饮食习惯及24 h膳食回顾调查及膳食频率问卷调查等资料。

体格检查及样本收集测量身高、体重、腰围、血压、心率，检查静态心电图、视力和眼底等。每人抽取清晨空腹静脉血5 ml于10 ml(含1 ml 2%EDTA-Na2)抗凝管中，现场分离血浆，取上层血浆低温保存，以测定电解质及其他生化指标，下层血细胞 (包括红细胞和白细胞)冰冻在-20℃冰箱内，用于基因组DNA的提取和基因分析。同时取晨尿100 ml于干净玻璃瓶中封口待测，低温保存。

实验室检查采用全自动生化分析仪 (在新疆医科大学第一附属医院检验中心完成)测定电解质、血糖、血脂、肝肾功能、血清铁;检测血清免疫球蛋白、补体C3、补体C4、抗链球菌溶血素O、类风湿因子、超敏 C-反应蛋白 (high sensitive C-reactive protein，hs-CRP)等，以评估机体的免疫功能。尿样检查项目:尿十项、尿钾、尿钠、尿钙、尿镁、尿肌酐、24 h尿总蛋白、尿微量白蛋白等。

基因组DNA提取采用经典的酚—氯仿抽提法［2］，根据红、白细胞渗透脆性不同的特点，用低渗法去除红细胞，然后在蛋白酶K及十二烷基磺酸钠 (sodium dodecyl sulfate，SDS)的作用下37℃消化过夜，等体积酚—氯仿抽提去除蛋白，最后乙醇沉淀析出基因组 DNA，溶于 TE缓冲液 (10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)中，4℃保存。紫外分光光度法测定基因组DNA样品的纯度，OD260/OD280比值在1.8～2.0之间。

基因型鉴定采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性 (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)和琼脂糖凝胶电泳的方法鉴定 ACE基因、CYP11B2基因C-344T的基因型 (在中国医学科学院基础医学研究所完成)。PCR扩增反应采用PTC-100 PCR扩增仪 (型号:MA02172，美国 BIO-RAD公司)，反应体系为25 μl。PCR扩增反应引物、扩增片段长度、酶以及酶切片段见表1。PCR扩增条件:ACE基因:94℃ 5 min，94℃ 40 s，58℃ 40 s，72℃ 40 s，35个循环，72℃ 5 min;C-344T:94℃ 5 min，94℃ 60 s，62℃60 s，72℃ 90 s，35个循环，72℃ 10 min。

PCR产物序列分析分别从“沙漠人”组随机选取50个样本和对照组中随机选取20个样本进行直接测序 (由北京奥科生物科技发展有限公司完成)，结果表明酶切方法鉴定的基因型与测序鉴定的基因型的符合率达100%。

质量控制调查主要由心血管内科专职工作人员操作，均严格经过营养膳食调查培训，并配有精通维吾尔语的专业医务工作者进行语言翻译。血生化分析测定及基因检测采用盲法，均由专业人员完成。膳食调查采用24 h膳食回顾调查及膳食频率问卷调查法，运用中国疾病预防控制中心营养计算器V1.6软件进行每人每日营养素摄入量及能量比计算。

统计学处理应用SPSS 15.0统计分析软件进行统计学处理。连续变量用均数±标准差表示。所用资料在进行两组分析比较时，资料符合正态分布且方差齐时，均数间比较采用t检验;资料符合正态分布但方差不齐时，均数间比较采用t'检验。计数资料用构成比、率描述其基本特征，各组间频率比较采用2×2、R×C列联表χ2检验。等位基因和基因型频率的估计采用基因记数方法。Hardy-Weinberg平衡用χ2检验。采用χ2检验法估计每个多态性位点与“沙漠人”热习服生理特性之间的关联性以及是否具有统计学意义。所有的统计学检验以双侧概率P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

“沙漠人”与对照组一般体征及血脂、血糖水平的比较“沙漠人”组男293名，女210名，平均年龄 (35.72±16.40)岁;对照组男138名，女99名，平均年龄 (37.30±18.31)岁。两组间年龄和性别构成比差异无统计学意义 (P＞0.05)。“沙漠人”组腰围和体重指数明显小于对照组，差异有统计学意义 (P＜0.01)。“沙漠人”组平均舒张压、收缩压和空腹血糖水平均明显低于对照组，差异有统计学意义 (P＜0.001);血脂除高密度脂蛋白胆固醇明显高于对照组外 (P＜0.001)，甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇均明显低于对照组(P＜0.01)(表2)。若按两组间发病率计算比较，“沙漠人”高血压、高血脂、糖尿病发病率均明显低于对照组，差异有统计学意义 (P＜0.05)。

表1 PCR扩增反应的引物序列及酶切反应条件

表2 “沙漠人”组与对照组的一般体征、血压、血脂、血糖水平的比较 (±s)

表2 “沙漠人”组与对照组的一般体征、血压、血脂、血糖水平的比较 (±s)

BMI:体重指数;TG:甘油三酯;TC:总胆固醇;LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇:HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇;1 mm Hg=0.133 kPa

BMI(kg/m2)腰围(cm)收缩压 (mm Hg)舒张压 (mm Hg)组别例数 数值对照组 237 22.66±4.18 237 77.25±10.16 237 122.57±21.43 237 80.35±15.40“沙漠人”组 503 21.25±3.10 503 73.43± 9.10 503 109.81±18.36 503 72.58±11.39 t值例数 数值 例数 数值 例数 数值-3.21 -3.73 -5.58 -4.81 P值 0.002 0.000 0.000 0.000 TG(mmol/L)TC(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)空腹血糖 (mmol/L)组别例数 数值对照组 235 1.50±1.29 235 3.26±0.85 235 0.53±0.23 235 1.66±0.60 235 5.56±1.39“沙漠人”组 500 0.98±0.77 500 2.23±1.02 500 0.72±0.33 500 1.41±0.68 500 4.43±1.19 t值例数 数值 例数 数值 例数 数值 例数 数值0.000 0.000 0.000 0.001 0.000-3.98 -10.69 6.60 -3.42 -6.78 P值

“沙漠人”与对照组血液中免疫球蛋白水平的比较“沙漠人”组血清IgG、IgA和对照组比较差异无统计学意义 (P＞0.05);IgM水平明显低于对照组，差异有统计学意义 (P＜0.001);hs-CRP水平明显高于对照组，差异有统计学意义 (P＜0.05)(表3)。

“沙漠人”与对照组主要血清电解质及其摄入量的比较“沙漠人”血清钠水平高于对照组，血清钾水平低于对照组，差异均有统计学意义 (P＜0.001)。 “沙漠人”血清电解质有高钠低钾特点。而“沙漠人”膳食中盐、钠、钾摄入量均低于对照组，差异有统计学意义 (P＜0.001)(表4)。

Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验ACE基因和CYP11B2基因C-344T位点的各基因型频率在“沙漠人”组和对照组中的分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律 (ACE基因: “沙漠人”组P=0.928，对照组P=0.712;C-344T位点:“沙漠人”组P=0.06，对照组P=0.271)，说明所选择的样本具有群体代表性。

ACE基因的单位点分析ACE基因I/D多态性的基因型和等位基因频率在“沙漠人”组和对照组间的分布见表5。ACE基因的基因型和等位基因频率在两组间的差异均无统计学意义 (P＞0.05)。

CYP11B2基因C-344T的单位点分析CYP11B2基因C-344T位点的基因型和等位基因频率在“沙漠人”组和对照组间的分布见表5。该位点基因型和等位基因频率的分布在两组间的差异均具有统计学意义 (P＜0.05)。该位点携带T等位基因的基因型在“沙漠人”组高于对照组 (OR=1.48;95%CI:1.082～2.023)，可能为有利于“沙漠人”热习服的因素。

CYP11B2基因的单倍型分析CYP11B2基因C-344T和K173R两个多态性位点构成的4个单倍型在“沙漠人”组和对照组间总体上差异无统计学意义 (χ2=6.88，P=0.076)。但在所有单倍型中，包含CYP11B2基因-344T和173K等位基因的H1单倍型在“沙漠人”组明显高于对照组，差异有统计学意义 (χ2=4.898，P=0.027)(表 6)。

表3 “沙漠人”组与对照组人群血清免疫球蛋白水平的比较 (±s)

表3 “沙漠人”组与对照组人群血清免疫球蛋白水平的比较 (±s)

组别 超敏C反应蛋白 (mg/L)IgG(g/L)IgA(g/L)IgM(g/L)对照组 (n=235)“沙漠人”组 (n=500)0.49±1.22 1.85±6.15 9.62±2.71 9.67±4.36 1.59±0.92 1.48±0.93 1.54±0.62 1.23±0.58 t值 P值2.410 0.018 0.151 0.880-1.052 0.293-4.781 0.000

表4 “沙漠人”与对照组主要血清电解质及其膳食摄入量的比较 (±s)

表4 “沙漠人”与对照组主要血清电解质及其膳食摄入量的比较 (±s)

组别 血清钾 (g)血清钠(g)摄盐量 (g)钠摄入量(g)钾摄入量(g)对照组 (n=235)4.60±0.53 138.30±4.06 10.85±2.44 4.60±1.18 3.26±0.77“沙漠人”组 (n=500)4.29±0.57 143.26±4.66 5.02±1.43 2.26±0.66 2.05±0.61 t值-4.34 5.38 -22.43 -18.66 -14.22 P值0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表5 ACE基因和CYP11B2基因C-344T位点的基因型及等位基因频率在“沙漠人”组和对照组的分布

表6 “沙漠人”组与对照组CYP11B2基因C-344T和K173R两个多态性位点单倍型的比较

讨 论

热习服是机体在长期反复热作用下出现的一系列适应性反应，表现为机体对热的反射调节机能更趋完善，各种生理机能达到一个新的水平，如代谢率降低，出汗散热作用增强，体温脉搏呼吸反应稳定，汗中氯化钠含量降低，肌肉活动能力明显提高，主观感觉好转，中暑发生率降低。热习服的生理表现主要体现在体温调节、出汗机能、水盐代谢、心血管系统功能的适应性变化等方面［2］。

塔克拉玛干沙漠几乎终年不下雨，加上太阳的烘烤和超量的蒸发，使得这里极度干旱，成为世界少有的干极、热极之一。“沙漠人”对干热环境的耐受超乎人们所想象，他们在酷热难耐、白天气温高达50℃的环境下，很少出汗，也无口渴表现，表现出对干旱、酷热极端环境的超强适应能力。这一人群必然有其特殊的体质指标和电解质酸碱平衡状态，也肯定会有特殊的遗传基础。由于“沙漠人”所处的特殊地理位置以及交通的险阻，使得他们很少与外界联系，更重要的是他们也几乎不与外界通婚，因此其基因多态性还未受到外部人群的干扰，这在当今世界上也是极其罕见的，是进行基因研究的宝贵群体［3-4］。

本研究结果显示“沙漠人”组腰围和体重指数均显著小于对照组人群，这可能与“沙漠人”为适应这种极端干热环境有关。免疫球蛋白是一组具有抗体活性的蛋白质，是检查机体体液免疫功能的重要指标。“沙漠人”组血清IgM平均水平显著低于对照组人群，这可能与沙漠中气候干热，与外界隔绝，没有蚊蝇，不利于细菌和病毒生存，因而各种流行病和传染病较少有关。此外，“沙漠人”组血清hs-CRP水平显著高于对照组，可能与沙漠严酷环境的应激反应增加有关。

“沙漠人”组膳食中盐、钠、钾摄入量均显著低于对照组，而其血清钠水平显著高于对照组，血清钾水平显著低于对照组，说明“沙漠人”血清电解质有高钠低钾特点。众所周知，醛固酮具有保钠排钾作用，推测“沙漠人”血清电解质高钠低钾特点可能与“沙漠人”为适应沙漠干热环境，肾素-血管紧张素-醛固酮系统发生适应性改变，机体合成分泌醛固酮增多，发挥保水保钠作用来维持体液和电解质平衡有关。

血管紧张素作用于肾血管，使肾血管收缩，肾血流量减少，从而发挥保水、保钠作用，血容量增加，有利于机体热习服。但本研究结果显示:ACE基因的I/D多态性的各基因型和等位基因频率的分布在“沙漠人”组和对照组间的差异均无统计学意义，提示单基因单位点分析“沙漠人”ACE基因的I/D多态性与“沙漠人”热习服生理特性无关联。但这并不能排除该基因其他区域的变异或与邻近基因的交互作用在“沙漠人”热习服生理特性中的作用。

醛固酮是人体内最重要、作用最强的盐皮质激素，在机体水盐代谢及维持电解质平衡中发挥重要作用。醛固酮合成酶是醛固酮生物合成过程中催化最后一步生化反应的关键酶，醛固酮合成酶基因CYP11B2调控醛固酮合成酶的生成而与机体热习服相关联，目前有关CYP11B2基因多态性位点的研究主要包括启动子区的C-344T和第三外显子的K173R，其中研究较多的是C-344T位点多态性。本研究结果显示:CYP11B2基因C-344T位点的各基因型和等位基因频率的分布在“沙漠人”组和对照组间的差异均具有统计学意义，该位点携带T等位基因的基因型在“沙漠人”组高于对照组 (OR=1.48;95%CI:1.082～2.023)。单倍型分析也支持上述结论，CYP11B2基因C-344T和K173R两个多态性位点构成的4个单倍型在“沙漠人”组和对照组间总体上差异无统计学意义 (P＞0.05)。但在所有单倍型中，包含CYP11B2基因-344T和173K等位基因的单倍型在“沙漠人”组高于对照组，差异有统计学意义 (P＜0.05)。因此推测，该位点携带T等位基因的基因型可能为有利于“沙漠人”热习服的因素。

结合“沙漠人”的特殊生理特征分析， “沙漠人”为适应干热生存环境，维持体液和电解质平衡，机体合成分泌醛固酮增多，因此调控醛固酮合成分泌的醛固酮合成酶基因发生突变，突变为携带T等位基因的基因型个体。已有研究证明在干热环境下，醛固酮合成酶基因表达水平和酶活性的改变可直接影响醛固酮的分泌，进而影响水盐代谢的平衡。在CYP11B2基因-344T/C多态性的研究中，发现不同基因型人群的醛固酮浓度不同。Hautanen等［5］对正常男性进行尿醛固酮定量检测发现:-344TT基因型较-344CC基因型有较高的尿醛固酮含量;Davies等［6］发现T等位基因正常人群的24 h尿醛固酮定量明显高于C等位基因人群;Paillard等［7］在正常人群CYP11B2基因-344T/C多态性与血浆醛固酮浓度的研究中，发现T等位基因与高醛固酮浓度密切相关。因此推测“沙漠人”为适应干热环境而发生CYP11B2基因C-344T位点向携带T等位基因的基因型增多的趋势突变。这同时也表明塔克拉玛干“沙漠人”热习服生理特性与CYP11B2基因C-344T多态性相关联。

另外，本研究还可以对既往研究中ACE、CYP基因与糖尿病、高血压、高血脂关系报道不一的现象［8］有所启示:在研究基因突变与疾病关系时还要考虑环境因素引起的基因突变。

［1］韩建康，刘业祥，刘永健.塔克拉玛干沙漠周边地区20世纪前半叶夏季气温趋势变化［J］.干旱区地理，2007，30(1):36-37.

［2］Kanai N，Fujii T，Saito K，et al.Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood ［J］.Clin Pathol，1994，47(3):1043-1044.

［3］Marie E，Sandström·Jason C，Siegler·Ric J，et al.The effect of 15 consecutive days of heat-exercise acclimation on heat shock protein 70 cell ［J］.Stress and Chaperones，2008，13(2):169-175.

［4］玉素甫江·阿尔拉，程祖亨，汤宝鹏，等.塔克拉玛干“沙漠人”心电图明尼苏达编码分析 ［J］.中华医学杂志，2006，86(47):3277-3279.

［5］Hautanen A，Lankinen L.Associations between aldosterone synthase gene polymorphism and the adrenocortical function in males［J］.J Intern Med，1998，244(3):11-18.

［6］Davies E，Holloway CD，Ingram MC，et al.Aldosterone excretion rat and blood pressure in essential hypertension are related to polymorphic differences in the aldosterone synthase gene CYP11B2 ［J］.Hypertension，1999，33(8):703-707.

［7］Paillard F，Chansel D.Genotype-phenotype relationships for the renin-angioensin-aldosterone system in a normal population［J］.Hypertension，1999，34(6):423-429.

［8］Marshall HC，Ferguson RA，Nimmo MA et al.Human resting extracellular heat shock protein 72 concentration decreases during the initial adaptation to exercise in a hot，humid environment［J］.Cell Stress Chaperones，2006;11(2):129-134.