HPLC法同时测定皱皮木瓜中原儿茶酸和绿原酸的含量

李 霞 杨颖博 李君丽 陈 程 陈万生 孙连娜▲

1.第二军医大学药学院，上海 200433；2.第二军医大学附属长征医院药学部，上海 200403

HPLC法同时测定皱皮木瓜中原儿茶酸和绿原酸的含量

李 霞1，2杨颖博2李君丽1陈 程1陈万生2孙连娜1▲

1.第二军医大学药学院，上海 200433；2.第二军医大学附属长征医院药学部，上海 200403

目的 建立皱皮木瓜中主要有效成分原儿茶酸和绿原酸的高效液相色谱含量测定方法。 方法 采用Dikma Diamonsil C18色谱柱 （4.6mm×250.0mm，5 μm），甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脱，流速：1.0mL/min，柱温：30℃，检测波长：254 nm。 结果 原儿茶酸在 16.66～533.00 μg（r=0.999 9），绿原酸在 23.91～765.00 μg（r=0.999 5），线性关系良好；两个化合物的平均回收率分别为100.11%（RSD=0.90%，n=6）及99.06%（RSD=0.52%，n=6）。 结论 该方法简便快速，分离效果好，灵敏度高，重现性好，可为全面控制皱皮木瓜质量提供参考。

木瓜药材；高效液相色谱法；含量测定；原儿茶酸；绿原酸

皱皮木瓜为蔷薇科木瓜属植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥成熟果实，主产安徽、山东、浙江、湖北、云南、贵州、四川等地。皱皮木瓜作为一种常用中药，味酸，性温，入肝、脾经，具有舒筋活络、和胃化湿的功效，主治风湿痹痛、肢体酸重、筋脉拘挛、吐泻转筋、脚气水肿等症，临床主要用于治疗腰酸腿痛、霍乱、风湿性关节炎、四肢转筋、大吐泻、脚气水肿等疾病[1]。相关学者从木瓜中先后分离得到了有机酸类、三萜类、黄酮类等多种化学成分[2]。

笔者在对皱皮木瓜的研究中发现绿原酸与原儿茶酸是其中的主要成分。绿原酸，具有广泛的利胆、抗菌、抗病毒、升高白细胞等作用；原儿茶酸，具有增加冠脉流量、降低心肌耗氧量、缓解心绞痛等作用[3-6]。目前国内关于皱皮木瓜药材酚酸类成分的含量测定方法的文献报道较少[7-11]，尚未见有关同时测定木瓜药材中绿原酸和原儿茶酸含量的文献报道。本文采用高效液相色谱法同时测定了木瓜药材中绿原酸与原儿茶酸的含量，为评价和控制木瓜药材的质量提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters液相色谱仪（PDA检测器），Empower工作站；Sartorious BT 25S型1/10万电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；2500DE型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

1.2 试药

原儿茶酸、绿原酸对照品均为自制（色谱检查纯度大于98%），甲醇为色谱醇，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。16批木瓜药材主要由山东、河南、安徽、四川等产地收集，经第二军医大学张汉明教授鉴定分别为皱皮木瓜Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai和光皮木瓜 C.sinensis（Thouin）Koehne的干燥近成熟果实，见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Dikma Diamonsil C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流动相：0.1%甲酸（A）-甲醇（B）梯度洗脱，20%～25%A（0～25min），25%A（26～35 min），25%～20%A（36～40 min）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：254 nm；进样量：20 μL。依上述色谱条件，分别精密吸取原儿茶酸和绿原酸对照品溶液和供试品溶液各20μL，分别进样。在对照品溶液和供试品溶液色谱图相应位置上，有相同保留时间的色谱峰，见图l。

表1 木瓜药材信息表

2.2 供试品溶液的制备

取木瓜药材细粉1 g，精密称定，置具塞玻璃瓶中，精密加入20%甲醇20 mL，称定重量，浸泡过夜后，超声提取30min，放冷，再次称定重量，用20%甲醇补足重量，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜再过滤，作为供试品溶液置于4℃冰箱保存。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取干燥后的原儿茶酸和绿原酸对照品分别为5.33、7.65mg，用20%甲醇溶解定容至10mL容量瓶，0.45μm微孔滤膜过滤，续滤液即为对照品溶液。

2.4 线性关系考察

将原儿茶酸、绿原酸对照品储备液按 1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32比例制成6个不同浓度的对照品溶液，各依法进样20μL，测定各色谱峰峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度（mg/mL）为横坐标，进行线性回归分析，结果见表2。

表2 四种对照品的回归方程和线性范围

2.5 精密度考察

取木瓜药材细粉按“2.2”项下方法，制备供试品溶液。在“2.1”项下色谱条件，取供试品溶液进样20μL，连续进样6次，记录峰面积，测定原儿茶酸和绿原酸色谱峰峰面积的RSD分别为1.58%和1.03%，表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性考察

取“2.5”项下供试品溶液，分别于制备后 0、2、4、8、16、24 h安排进样，每次20μL，记录峰面积，测定原儿茶酸、绿原酸色谱峰峰面积的RSD分别为1.83%和1.64%，表明样品在24 h内基本稳定。

2.7 重复性考察

取同一批木瓜药材细粉，精密称定6份，按“2.2”项下制备6份供试品溶液，平行测定，计算原儿茶酸平均含量为0.054（RSD=1.27%），绿原酸平均含量为 0.152（RSD=1.78%），表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率考察

称取已知含量的木瓜药材细粉6份，每份约1 g，精密称定，分别精密加入一定浓度的两个对照品，按“2.2”项下制成供试品溶液，每份样品进样20μL，进行测定，计算回收率。结果见表 3、4。

表3 原儿茶酸加样回收率

表4 绿原酸加样回收率

2.9 样品含量测定

精密称取16批不同产地及品种木瓜药材各3份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行测定，以外标法计算两种成分的含量，结果见表5。

表5 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

3.1.1 流动相的选择 预实验中分别考察了甲醇-水系统，乙腈-水系统和甲醇-0.1%甲酸水系统，发现甲醇-0.1%甲酸水系统分离效果比较好，各色谱峰都得到了较好的分离，为了保证在适宜的分析时间内使各色谱峰均达到较好的分离，故采用甲醇-0.1%甲酸水系统梯度洗脱。

3.1.2 检测波长的选择 实验中用紫外分光光度计检测了原儿茶酸和绿原酸的检测波长，发现原儿茶酸在254 nm处有最大吸收，绿原酸的最大吸收虽然在327 nm，但是在254 nm处有肩峰，为了同时检测两个化合物的含量，故选择254 nm为检测波长。

3.1.3 柱温的考察 实验中考察了25、30、35℃三种柱温，结果表明：温度为30℃时，原儿茶酸和绿原酸的分离度较好。

3.1.4 流速的考察 实验中考察了不同的流速。当流速为0.8mL/min时，峰形展宽；流速为1.2mL/min时，峰形改善不大，考虑到柱压，最终确定流速为1.0mL/min。

3.2 含量测定结果分析

根据样品测定结果，不同品种的木瓜药材成分有明显差异，在皱皮木瓜中都含有化合物原儿茶酸和绿原酸，而光皮木瓜中只有原儿茶酸，未检测到绿原酸。而不同产地的相同品种的木瓜药材中这两种成分的含量差异也比较大，山东各产地的皱皮木瓜中原儿茶酸和绿原酸成分的含量相对较高，各产地气候、土壤等环境条件可能是影响含量的重要因素。

本研究同时测定了木瓜药材中主要成分原儿茶酸、绿原酸的含量，结果显示该方法灵敏度高，重复性好，样品处理方法简单，为木瓜药材的质量控制提供了参考依据。

[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：57.

[2]吴虹，魏伟，吴成义.木瓜化学成分及药理活性的研究[J].安徽中医学院学报，2004，23（2）：62-64.

[3]国家医药管理局中草药情报中心站.植物药有效成分手册[M].北京：人民卫生出版社，1998：209-210.

[4]季字彬.中药有效成分药理与应用[M].哈尔滨：黑龙江科学技术出版杜，1995：110.

[5]江苏省植物研究所，中国科学院昆明植物研究所，中国医学科学院药用植物资源开发研究所.新华本草纲要[M].3册.上海：上海科学技术出版社，1990：95.

[6]饶曼人.原儿茶酸对缺血区心肌代谢及心肌梗塞范围的影响[J].中国药理学报，1988，9（1）：27-30.

[7]龚复俊，陈玲，卢笑丛，等.皱皮木瓜果实中有机酸成分的GC-S分析[J].植物资源与环境学报，2005，14（4）：55-56，58.

[8]陶君彦，张晓昱，黄志军，等.HPLC法同时测定木瓜中绿原酸、咖啡酸的含量[J].中国药房，2007，18（12）：912-914.

[9]李荣华，高逢喜，任贻军.RP-HPLC法测定木瓜中原儿茶酸的含量[J].中国药师，2010，13（2）：179-180.

[10]陈建真，敖志辉，陈建明.不同产地木瓜及其酒制品中绿原酸的HPLC含量测定研究[J].医学研究杂志，2010，39（1）：86-88.

[11]陈洪燕，万明，严宜昌，等.两种产地木瓜不同处理方法的HPLC指纹图谱研究[J].湖北中医杂志，2010，32（2）：72-73.

Simultaneous determ ination of protocatechuic acid and chlorogcnic acid in Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakaiby HPLC

LIXia1,2 YANG Yingbo2 LIJunli1 CHEN Cheng1 CHENWansheng2 SUN Lianna1▲
1.SchoolofPharmacy,theSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai 200433,China;2.DepartmentofPharmacy,Changzheng Hospital Affiliated to the Second Military Medical University,Shanghai 200403,China

Objective To develop an HPLCmethod for the simultaneous quailtitation of protocatechuic acid and chlorogcnic acid in Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai.MethodsSamples were analyzed on Dikma Diamonsil C18column(4.6 mm×250.0mm,5μm),eluted withmethanol and water containing 0.1%formic acid asmobile phases in a linear gradientmode.The flow rate was kept at 1.0 mL/min and the column temperature was set to 30℃,the detector wavelengthswere 254 nm.ResultsThe linear rangeswere 16.66-533.00μg(r=0.999 9)for protocatechuic acid,23.91-765.00μg(r=0.999 5)for chlorogcnic acid.The average recoveries of the two constituents were 100.11%(RSD=0.90%,n=6),99.06%(RSD=0.52%,n=6),respectively.ConclusionThemethod is sensitive,accurate,repeatable,and can be used for quality control of the fruits of Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai.

Chaenomeles speciosa;HPLC;Content determination;Protocatechuic acid;Chlorogcnic acid

O657.63

A

1673-7210（2012）12（a）-0110-03

国家科技重大专项子课题-重大新药创制项目（项目编号：2011 ZX09102-006-03）。

李霞（1982-），女，硕士研究生，主管药师；研究方向：天然产物化学与中药新药。

▲通讯作者

2012-09-19 本文编辑：卫 轲）