细胞周期蛋白激酶抑制剂flavopiridol对骨肉瘤耐药细胞MG63/ADR增殖抑制的体内外实验研究

李旭，李岩，程世孝，李雷明，孟凡贺，朱悦，范广宇

（中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳 1 1 0 0 0 1）

骨肉瘤是好发于青少年的常见原发性恶性骨肿瘤。尽管随着新辅助化疗、保肢体手术等综合治疗手段的开展，治疗成绩不断提高，但是仍有30%～40%的患者在接受初期大剂量辅助化疗后出现不伴有远隔转移的局部复发，考虑为肿瘤细胞出现耐药导致预后不良所致［1，2］。因此，在抗肿瘤治疗策略研发进程中，寻找具有抗肿瘤活性同时又能够对抗甚至逆转多药耐药活性的药物受到人们关注。前期研究表明，细胞周期蛋白激酶抑制剂flavopiridol可以有效抑制尤文肉瘤敏感细胞株以及耐药细胞株的增殖，并诱导其凋亡［3，4］。本研究中，我们观察该药物在体外、体内对骨肉瘤耐药细胞MG63/ADR的细胞增殖抑制效果及机制，旨在为细胞周期蛋白激酶抑制剂（cyclin dependent kinase inhibitor，CDKI）抑制骨肉瘤的耐药及复发提供新的理论依据。

1 材料与方法

1．1 试剂与仪器

Flavopiridol（由美国Aventis公司Jose-Ramon博士惠赠）以二甲基亚砜（DMSO，Sunland-chem公司）溶解，-20℃冰冻保存，保存初始浓度为10 mmol/L。RPMI培养液、小牛血清（美国Gibco公司）、噻唑蓝（MTT，Genview 公司）、碘化丙锭（PI，Sigma公司）、Triton-X100（Quantum公司）。

1．2 靶细胞与细胞培养

骨肉瘤敏感细胞株MG63及骨肉瘤耐药细胞株（MG63/ADR）为阿霉素（adriamycin，ADM）诱导的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）及多药耐药蛋白1（multidrug resistance protein1，MRP1）超表达的骨肉瘤多药耐药细胞［5］，为日本Kyushu大学小田义直教授赠与。将MG-63/ADR细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的细胞培养液，在37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中常规培养，隔日换液，用含0.125%胰酶和0.02%EDTA消化液隔天消化、传代，定期添加ADM（100 ng/mL）以维持P-gp高表达。

1．3 细胞增殖活性测定

将MG63及MG63/ADR细胞浓度调整为1×107/L，转入96孔板培养，100 μL/孔，24 h后，加入细胞和同等稀释度的DMSO为阴性对照组，ADM组浓度分别为 10，100，1 000，2 000，4 000，10 000，20 000，40 000，100 000 ng/mL，flavopiridol组浓度分别为 5，10，20，40，80，160，320，640，1280，2 560，5 120，10 240 nmol/L，9孔/组，每隔 24 h终止培养 3孔，72 h后结束全部实验。结束培养前每孔加入MTT 20 μL（浓度为5 g/L），置入培养箱3~4 h后离心，去上清液，加入 DMSO，每孔 200 μL，遮光下低速振荡 10 min，在酶联检测仪测定各组570 nm处OD值，描绘细胞增殖曲线，计算细胞生长抑制率、药物的IC50及耐药倍数。细胞生长抑制率=1-（Aflavopiridol组-A空白组）/（AADM组-A空白组）×100%；耐药倍数=IC50耐药细胞/IC50敏感细胞。实验重复3次。

1.4 细胞周期测定

实验组和阴性对照组各设3个平行培养皿。Flavopiridol作用48 h后（浓度分别为100 nmol/L，200 nmol/L，400 nmol/L），每组收集 5×105个细胞，PBS液漂洗离心后，加入70%冷乙醇4℃固定至少24 h，检测前0.5%TritonX-100及RNase酶处理，调细胞数至1×105/mL，加入PI染色液1 mL，37℃孵育30 min，4℃染30 min，于流式细胞仪上测定细胞周期，数据经LvsisⅡ软件收集并分析。实验重复3次。

1.5 免疫印迹法测定

检测给药后 pro-caspase-9、pro-caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bcl-xL、p53、Bax以及 cleaved-PARP 表达水平的变化。收集对照组和经不同浓度flavopiridol处理48 h的细胞（浓度分别为100 nmol/L，200 nmol/L，400 nmol/L），以细胞裂解液裂解，提取蛋白并定量后，分别取50 μg加入上样缓冲液，经95℃变性10 min，8%～12%的聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后，加一抗室温孵育2 h；TBST洗涤3次，每次10 min，二抗（辣根过氧化物酶标记，1∶2 000稀释）室温孵育2 h；TBST洗涤3次，加入ECL化学发光试剂后放入暗盒中压片并依次显影、固定、照相。实验重复3次。

1.6 裸小鼠皮下种植瘤模型制作

取5周龄BALB/C裸鼠30只，制备细胞悬液（2×108/mL），每只裸鼠背部皮下注射细胞悬液0.1 mL。8 d后27只小鼠出现皮下结节（直径5～6 mm）。将造模成功裸鼠随机分为对照组（9只），5 mg·kg-1·d-1组（9只）和7.5 mg·kg-1·d-1组（9只），实验组分别每天腹腔内注射flavopiridol（5 mg/kg和7.5 mg/kg），对照组注射同体积PBS缓冲液，连续5 d。每3天测量1次肿瘤长径（a）和短径（b），计算肿瘤体积：V=a×b2/2。成瘤后观察4周，绘制肿瘤生长曲线。肿瘤生长抑制率=（1-处理组瘤质量/对照组瘤质量）×100%。并每周测量裸鼠体质量。

1.7 统计学分析

采用SPSS 10.0软件，实验数据以x±s表示。采用单因素方差分析（ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Flavopiridol对骨肉瘤耐药细胞增殖影响

MTT试验结果显示，ADM对敏感细胞的IC50为220 ng/mL，对耐药细胞的IC50为3 100 ng/mL，其耐药倍数为14.1倍。而flavopiridol对敏感细胞及耐药细胞的IC50分别为160 nmol/L和185 nmol/L，耐药倍数仅为1.15倍，其中flavopirdol能有效抑制MG63/ADR细胞增殖（表1）。

2.2 Flavopiridol对骨肉瘤耐药细胞MG-63/ADR细胞周期的影响

如表2所示，Flavopiridol作用MG63/ADR细胞后，对照组 Sub-G1期为（4.42±0.25）%，实验组 Sub-G1期比率随flavopiridol给药浓度增加而逐渐上升，各实验组与对照组差异均有统计学意义（P<0.05）。而G0/G1期比率在低浓度（100 nmol/L）给药时较对照组上升，当浓度上升至200 nmol/L以上时则明显下降，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

表1 F l a v o p i r i d o l对骨肉瘤耐药细胞MG 6 3/A D R的抑制率（%）Tab.1 Effect of flavopiridol on proliferation of MG63/ADR cells（%）

表2 F l a v o p i r i d o l给药后骨肉瘤耐药细胞MG 6 3/A D R的细胞周期分布（%）Tab.2 Effect of flavopiridol on apoptosis and cell cycle of MG63/ADR cells（%）

2.3 Flavopiridol对耐药细胞中细胞凋亡蛋白表达的影响

结果显示，耐药细胞株中的pro-caspase-9、procaspase-3、Bcl-2以及Bcl-xL的表达下降，活化型caspase-8、PARP-85的表达增加，其效应具有剂量相关性，而p53及Bax的表达无变化（图1）。

2.4 裸小鼠体内抑瘤实验结果

在falvopiridol连续给药5 d后，实验组和对照组肿瘤体积从第12天起各观测时点比较差异有统计学意义（P<0.05）。抑瘤率分别为 68.0%（5 mg·kg-1·d-1组）和 89.1%（7.5 mg·kg-1·d-1组），与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。给药2周后小鼠体质量各实验组与对照组差异无统计学意义（P>0.05，表 3）。

3 讨论

Flavopiridol作为一种新发现的小分子CDKI，最初来源于一种印度植物的茎皮提取液，其分子量约401.84。既往在针对食道癌、非小细胞肺癌及前列腺癌的抗肿瘤药物筛选中发现，Flavopiridol可在体内外明显抑制增殖，其主要机制为通过抑制CDK2及CDK4/6激酶活性，抑制cyclinD1的基因表达，抑制真核细胞转录延伸因子P-TEFb的活性，以及下调NO合酶的活性等机制诱导细胞凋亡，相关药物的应用研究已经进入临床Ⅱ期实验，与其他药物的联合应用也已进入临床Ⅲ期实验，具有较为广阔的应用前景［6，7］。本实验所选用的耐阿霉素人骨肉瘤细胞株MG63/ADR细胞是一株典型的MDR细胞系，可以检测到稳定的P-gp及MRP1高表达，可对ADM及其他多种化学结构及功能完全不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药［5］。而既往研究表明flavopiridol在结构上存在特异表型，可成为P-gp底物，从而对抗P-gp对多数抗肿瘤药物所发挥的外排功能，即从结构上天然可对抗P-gp介导的耐药发生，此外还可作为多药耐药另一重要因子——ATP结合盒转运载体蛋白MPR1的调节剂［8］，对抗由MPR1所导致的多药耐药，从而对多药耐药细胞有效地发挥其细胞增殖抑制作用。尽管该假说在前列腺癌、肺癌的抗肿瘤耐药机制中已得以验证，但CDKI对原发性恶性骨肿瘤耐药细胞的增殖抑制作用却鲜见报道。本研究结果表明，flavopiridol可有效抑制骨肉瘤敏感株及耐药株细胞的增殖，并诱导其凋亡，耐药株与非耐药株的IC50浓度相近，提示flavopiridol在应用于骨肉瘤治疗时与阿霉素等经典的抗肿瘤药物不发生交叉耐药。细胞周期分析及Western blot法检测凋亡相关蛋白表达实验的结果进一步表明flavopiridol在高浓度时主要是通过诱导细胞凋亡抑制耐药骨肉瘤细胞的增殖。裸鼠移植瘤的动物实验结果也显示flavopiridol可于体内有效抑制骨肉瘤耐药细胞的增殖。

表3 F l a v o p i r i d o l对裸鼠移植瘤生长的抑制作用比较（x±s，mm3）Tab.3 Antiproliferative effects of flavopiridol on MG63/ADR cells in vivo（x±s，mm3）

细胞凋亡又称细胞程序性死亡，迄今为止的研究表明，细胞凋亡的主要通路有线粒体通路、死亡受体通路及内质网通路。细胞凋亡通路在耐药机制研究中，线粒体凋亡通路的诱导占有十分重要的地位。而在线粒体凋亡通路中，Bcl-2家族成员发挥着至关重要的作用，该家族成员中Bax、PUMA、Noxa、Bid、Bcl-2等相当一部分的因子是p53蛋白信号转导通路的下游靶基因。Bcl-2是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一，其抗凋亡Bcl-2家族成员（Bcl-2、BclxL）的过度表达利于细胞的生存，是阻断细胞凋亡的最后共同通路的关键蛋白，与凋亡逃避和化疗抗药性密切相关；而促凋亡Bcl-2家族成员（Bax和Bak）和 BH3 惟一蛋白（Bid、Bim、Bik、PUMA、Noxa）的活性增加则可提高恶性细胞对凋亡的敏感性，从而克服药物耐受［9］。在p53野生型细胞中，抗肿瘤药物所导致的Bax/Bcl-2比例的升高是细胞凋亡诱导的常见变化之一。而在本研究中所使用的MG63/ADR细胞为p53突变型细胞株，细胞凋亡相关因子的免疫印迹分析结果表明，flavopiridol给药后p53及其下游靶因子Bax的表达无变化，而Bcl-2及Bcl-xL的表达被下调，提示其可能通过其他的非p53依赖的线粒体激活路径发挥了促细胞凋亡的效果［10，11］。caspase是一种门冬氨酸依赖性的半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡中起着不可替代的重要调控作用。caspase通路是诸多调控通路的关键，各凋亡通路最后都有caspase的激活。此外，P-gp还具有抑制细胞caspase依赖性凋亡的作用。细胞的凋亡分为caspase依赖性和非依赖性两种，P-gp对非依赖性细胞凋亡没有抑制作用，但P-gp的高表达能抑制由细胞毒药物、自由基以及放射线等因素引起的caspase依赖性凋亡［12］。曾有研究表明，caspase-3、caspase-8 和caspase-9的激活通路的功能抑制可能是P-gp参与细胞耐药发生的作用机制之一［13］。本研究结果显示在耐药骨肉瘤细胞中导入flavopiridol后，caspase-3、caspase-8及caspase-9的表达可能被再度激活，从而抵消了P-gp对3者的激活抑制作用，进而增强促耐阿霉素骨肉瘤细胞凋亡的效果。

综上所述，本研究通过体外及体内的联合实验确认flavopiridol可明显抑制人耐阿霉素骨肉瘤细胞株MG63/ADR的增殖，其具体机制可能为通过激活非p53依赖的线粒体信号传导通路以及诱导MG63/ADR细胞凋亡及激活死亡受体介导的caspase信号传导途径。这为未来临床应用小分子CDKI治疗耐药性的骨肉瘤患者提供了新的有力的实验室依据。

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