阳离子卟啉对宫颈癌细胞株Caski的光动力学杀伤效应

吕昌帅，丁佰娟，刘洪丽，姜侃，张友忠

（山东大学齐鲁医院妇产科，济南 2 5 0 0 1 2）

阳离子卟啉（TMPyP4），即四-（N-甲基-4-吡啶基）卟啉，是一类卟啉类衍生物，能够选择性地在肿瘤组织中聚集，在正常组织中却代谢很快，因此长期以来在肿瘤治疗、尤其是光动力学治疗（photodynamic therapy，PDT）方面备受人们的关注。已有文献报道，TMPyP4可展开RNA的G-四倍体结构的极端稳定性，并通过中断G-四倍体链调节基因的活性［1］。PDT是一种新兴肿瘤治疗方法，其利用肿瘤细胞对光敏剂的特异性吸收和潴留，结合特定波长的激光照射，达到选择性杀伤肿瘤细胞的目的。Ki-67是目前公认的评价细胞增殖状态的指标。微型染色体维持蛋白（minichromosome maintenance proteins，MCMs）是一组蛋白家族，目前研究已证实其可作为增殖细胞的特异标记［2］。碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydraseⅨ，CA-Ⅸ）是碳酸酐酶家族异构体之一，参与细胞的增殖和转化［3］。核因子kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）是一种具有多向性调节作用的核转录因子，与肿瘤的发生发展、肿瘤细胞的浸润转移、抗凋亡及耐药性的产生密切相关［4，5］。多肿瘤抑制基因P16是一种细胞周期调控因子，负调节细胞增殖及分裂［6，7］。目前关于 TMPyP4-PDT作用于宫颈癌细胞株的临床研究较少，本研究通过观察TMPyP4-PDT对宫颈癌Caski细胞株细胞凋亡的效应，探讨TMPyP4-PDT对肿瘤细胞的杀伤作用及其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

TMPyP4，购自德国Merck公司；RPIM 1640培养基，购自美国GIBCO BRL公司；胎牛血清，购自杭州四季青公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT），购自Sigma公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，购自上海贝博生物公司；Trizol试剂，购自Invitrogen公司；RNase、逆转录试剂盒及PCR扩增试剂盒，均为东洋纺（上海）生物科技有限公司产品；实时荧光定量PCR所需引物，由上海博尚公司设计并合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：宫颈癌细胞株Caski培养于含有10%胎牛血清的RPIM 1640培养液中，在5%CO2浓度、饱和湿度、37℃孵育箱中培养，3~4 d传代1次，选取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 实验分组：分为正常对照组、单纯PDT组、单纯TMPyP4组和TMPyP4-PDT组。

1.2.3 MTT法检测细胞抑制率：将TMPyP4避光保存在4℃冰箱中，用不含胎牛血清的培养基配制成TMPyP4 终浓度分别是 0、3、6、15、30 和 60 μmol/L的孵育液。取对数生长期细胞制成单个细胞悬液，以5×103/孔接种到96孔细胞培养板，每孔加100 μL细胞悬液，在5%CO2浓度、饱和湿度、37℃孵育箱中培养24 h后，在严格避光的条件下加入上述浓度的TMPyP4孵育液，孵育4 h后，用波长630 nm、功率800 mW的半导体激光仪垂直照射，能量密度分别是0、2、4和8 J/cm2。照射后所有细胞换成含10%胎牛血清的培养液继续培养24 h。每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，继续避光培养 4 h，终止培养，小心弃上清，加入200 μL DMSO溶解MTT，轻轻震荡10 min，在酶联免疫检测仪上测定波长为490 nm处各孔的吸光度（A值）。实验重复3次。计算各组细胞的抑制率，细胞抑制率=1-（实验组A值/空白组A值）×100%。

1.2.4 形态学观察：各组细胞处理后继续孵育24 h，然后在倒置显微镜下观察细胞生长状况和生长形态。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡：选取TMPyP4药物浓度分别是 3、6、15、30 和 60 μmol/L，激光能量密度4 J/cm2为实验组。将TMPyP4处理后的各组细胞按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒的说明进行双染，即分别消化离心收集各组细胞，用冷PBS洗3次（1 000 r/min、4℃离心5 min），调整细胞浓度为 1×（105~106）/mL，将细胞悬浮于 200 μL 结合缓冲液中。加入5 μL的Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀，于2~8℃避光条件下孵育15 min，然后加入10 μL PI染色液后于2~8℃避光条件下孵育5 min，在1 h内采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.6 实时荧光定量PCR法检测TMPyP4-PDT对宫颈 癌 Caski 细胞 株 Ki-67、MCM2、P16、CA-Ⅸ 和NF-κBmRNA表达的影响：收集正常对照组和TMPyP4-PDT实验组细胞，提取总RNA，然后在紫外分光光度仪上测定RNA的浓度。按照逆转录试剂盒说明书进行RNA逆转录反应合成cDNA，接着进行荧光实时PCR，其10 μL反应体系为：蒸馏水3.2 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 5 μL，10 μmol/L的上游引物和下游引物各0.4 μL，模板DNA 1 μL。引物序列见表1。以GAPDH为内参对Ki-67、MCM2、P16、CA-Ⅸ和 NF-κB 进行扩增，采用相对定量法，检测TMPyP4-PDT作用24 h后上述基因的mRNA水平。三步法PCR扩增条件：95℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，58 ℃ 10 s，72℃ 15 s，共 40 个循环。PCR反应完成后进行融解曲线分析，以确定得到的扩增产物是否为单一目的片段。最后由计算机自动计算并导出相对应的阈值循环数。

1.3 统计学分析

应用SPSS 18.0统计学软件对实验数据进行统计分析，各组Caski细胞的A值、凋亡细胞百分比及Ki-67、MCM2、P16、CA-Ⅸ和 NF-κBmRNA 的表达水平均以x±s表示，多组间样本均数的比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 结果

2.1 A值测定结果

MTT法中，酶联检测仪各孔的A值可以间接地反映活细胞数量，在一定范围内与活细胞的数量成正比。由表2可知：在相同TMPyP4浓度下，随着激光能量密度的增大A值减小；在相同的激光能量密度照射下，随着光敏剂浓度的增大A值亦减小；单纯PDT组A值变化不明显。根据细胞抑制率绘制出不同TMPyP4浓度对Caski细胞株的抑制率曲线（图1）。在相同的激光能量密度条件下，随着TMPyP4浓度的增加，PDT效应越显著。单纯TMPyP4组对细胞增殖有明显的抑制作用（P<0.01），且呈剂量依赖性；单纯PDT组对细胞增殖的抑制作用不明显（P>0.05）；TMPyP4-PDT组对细胞增殖的抑制作用随着药物作用浓度及激光能量密度的增加而增强（P<0.01）。

表2 MT T检测不同浓度T MP y P 4和不同激光能量密度对C a s k i细胞A值的影响Tab.2 Different TMPyP4 concentrations and laser energy densities affect A value of Caski cells by MTT

2.2 细胞形态学观察

空白对照组细胞及单纯PDT组细胞呈多角形或梭形贴壁生长，细胞密集，生长状态良好。单纯TMPyP4组细胞随着药物浓度的增加，对Caski细胞株的抑制作用逐渐增强，细胞贴壁稀疏，部分细胞变成圆形，出现核固缩、空泡样改变。TMPyP4-PDT组细胞随着激光能量密度及药物浓度的增加，Caski细胞株的抑制作用逐渐增强，贴壁细胞数目明显减少，出现胞质空泡化、细胞体积缩小、细胞核碎裂及凋亡小体形成等。各组细胞的典型形态学变化见图2。

2.3 流式细胞仪检测结果

在激光能量密度为4 J/cm2的条件下，TMPyP4-PDT 组 TMPyP4 浓度为 3、6、15、30 和 60 μmol/L 时细胞凋亡率分别为（5.67±0.35）%、（13.50±0.62）%、（22.83±2.35）%、（34.47±1.88）%和（46.43±1.46）%。随着药物浓度的增加，细胞凋亡率逐渐增加，见图3。

2.4 TMPyP4-PDT 对 Caski细胞 Ki-67、MCM2、P16、CA-Ⅸ和 NF-κBmRNA 表达的影响

在激光能量密度为 4 J/cm2的条件下，3、6、15、30和 60 μmol/L的 TMPyP4作用4 h，Caski细胞 Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和 NF-κBmRNA 表达水平明显降低，P16mRNA表达水平升高，与正常对照组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。以GAPDH为内参照基因，Ki-67、MCM2、P16、CA-Ⅸ和 NF-κBmRNA 的表达水平变化见表3。

表3 各组C a s k i细胞中K i-6 7、MC M2、P 1 6、C A-Ⅸ和N F-κBmR N A表达变化Tab.3 Changes of expressions of Ki-67，MCM2，P16，CA-Ⅸ and NF-κB mRNA in Caski cells in various groups

3 讨论

肿瘤的PDT是继传统手术和放化疗之后，正在兴起的一种治疗肿瘤的新型医疗技术。这种治疗方法是基于将光敏剂选择性地富集在肿瘤细胞里，然后用一定波长的光激发产生单态氧直接损伤肿瘤细胞并在过氧化反应中产生丙二醛，其凋亡途径可能不依赖caspase-3［8］。与传统的治疗方法相比，PDT最大的优点是对肿瘤组织选择性杀伤效率高、毒副作用较小、收效快、重复应用不产生耐药性、在杀死肿瘤细胞的同时不危及正常组织细胞等。光敏剂是光动力治疗的关键［9，10］。TMPyP4 是水溶性阳离子卟啉衍生物，与正常的组织相比，可以在肿瘤组织中蓄积达到较高的浓度。有研究推测卟啉可与G-四分体结合，形成稳定的G-四联体结构，并且可以下调cmyc和hTERT基因的表达，抑制端粒酶的活性［11］，将其作用于肿瘤细胞可抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡。

有研究报道，Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和 NF-κB 等基因与细胞的增殖和转化有关，能够反映细胞增殖状态，有助于预测肿瘤复发风险［12~14］。P16基因是继P53、Rb抑癌基因之后被发现的又一引人注目的新的抑癌基因，也是人们发现的第一个直接作用于细胞周期的抑癌基因。P16是多肿瘤抑制基因，抑制细胞从G1期向S期转换，在细胞分化周期水平上参与细胞凋亡的发生［15，16］。

本研究MTT结果显示，A值随着TMPyP4浓度和照光剂量的增加而降低，单纯照光组A值变化不明显。TMPyP4-PDT对Caski细胞有明显的抑制作用，且其作用呈剂量依赖性。TMPyP4-PDT作用于宫颈癌Caski细胞后，细胞形态发生明显变化，倒置显微镜下可见胞质空泡化、细胞体积缩小、细胞核碎裂及凋亡小体形成等凋亡特征性变化。从组织形态学以及流式细胞凋亡检测分析看，PDT可显著诱导宫颈癌Caski细胞凋亡。

本研究实时荧光定量PCR结果显示，TMPyP4-PDT处理后的宫颈癌Caski细胞中Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和NF-κBmRNA表达水平显著低于对照组（P<0.05），表明TMPyP4-PDT光动力作用可以负性调节宫颈癌 Caski细胞 Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和 NF-κB的表达水平。而经TMPyP4-PDT处理后的Caski细胞中P16mRNA表达水平高于对照组（P＜0.05），提示TMPyP4-PDT光动力作用激活了P16基因功能，促使肿瘤细胞凋亡及坏死。根据这一结果推测TMPyP4-PDT作用于肿瘤细胞一段时间后，通过正性调节 P16以及负性调节 Ki-67、MCM2、CA-Ⅸ和NF-κB的表达从而抑制肿瘤细胞的增殖和转移。

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