黑米花色素苷对大鼠组织器官功能的影响

金丽琴，刘明达，吕建新，陈秀芳，钱 松

(温州医学院 1.基础学院 生化教研室，2.附属第一人民医院 第八院区，3.检验与生命科学院，4.药学院，浙江 温州 325035)

黑米(black rice)是重要的优异稻种资源，有丰富的营养价值和特殊的功能成分。其主要的活性成分黑米花色素苷(black rice anthocyanin，BA)是一类多酚类黄酮化合物。BA有抗氧化、清除自由基、保护心血管及抗肿瘤等作用［1-5］。目前，BA在活体组织中免疫活性研究报道较少，对机体器官组织的免疫调节功能及抗氧化作用未见报道。本实验从免疫学和生物化学的角度观察BA对大鼠组织器官中乳酸脱氢酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)等主要免疫和抗氧化生化指标的影响，探讨BA对大鼠组织器官的免疫调节功能及抗氧化作用，进而为推动开发BA作为营养保健食品资源和临床辅助药用资源提供理论指导和实验依据。

1 材料

RPMI 1640培养基，Gibeco公司;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司;AmberliteXAD-7大孔吸附树脂，上海罗门哈斯公司;LDH、ACP、AKP、SOD及MDA试剂盒，南京建成生物工程研究所。

雌性SPF级SD大鼠24只，10～12周龄，体重(170±15)g，由本院实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(浙)2003-0001。

LGJ0.5冷冻干燥器，北京四环科学仪器厂;U-niversal 32R低温离心机，德国;光谱扫描功能读数仪，芬兰 Thermo Scientific。

2 方法

2.1 BA 的制备

选取外被色深黑粳米，经碾米机过40目筛，制成黑米粉，加浸提液(含1.0%柠檬酸，60%乙醇)，水浴浸提，超声辅助，重复2次，减压浓缩，Amberlite XAD-7大孔吸附树脂吸附，80%乙醇洗脱，真空抽滤去杂;减压浓缩，经冷冻干燥得粉末状BA［6］。采用高效液相色谱法(峰面积归一法)测得总花色素苷含量为37.69%。

2.2 动物分组与处理

雌性SPF级SD大鼠24只随机均分为4组:对照组(生理盐水，2mL/kg);BA低剂量组(BA 25mg/kg);BA中剂量组(BA 50mg/kg);BA高剂量组(BA 100mg/kg)。每天在规定时间内，给大鼠称重，并按大鼠体重灌胃1次，连续给药30 d。大鼠股动脉放血处死后，剥取大鼠的胸腺、脾、肝和肾等脏器，称其湿重，以各脏器湿重除以大鼠体重，得湿重指数。

2.3 组织匀浆制备

将剥取的肝、肾、脾、胸腺组织用生理盐水洗去血污后，用滤纸吸干。每个脏器各取2份，每份0.2 g。用匀浆介质研磨成组织匀浆(200mg/mL)，于4℃，13 000 r/min离心10 min，取上清置1mL EP管内保存于－20℃待测。

2.4 生化指标的测定

LDH活力、ACP活力、SOD活力、GSH活力以及MDA含量的测定均按试剂盒说明书操作［7-8］。

2.5 数据处理和统计分析

3 结果

3.1 BA对大鼠的胸腺、脾、肝和肾湿重指数的影响

结果见表1。BA能使大鼠胸腺湿重指数显著增加(P＜0.05);BA高剂量组大鼠肝脏湿重指数显著提高(P＜0.05)。BA对脾、肾湿重指数无显著影响。

3.2 BA对大鼠胸腺、脾、肝、肾组织中LDH的影响

结果见表2。与对照组相比，BA使大鼠脾、肝和肾内的LDH活力显著升高(P＜0.05或0.01)，但对胸腺内的LDH活力无显著影响。

表1 BA对大鼠的胸腺、脾、肝和肾湿重指数的影响(±s，n=6)Tab.1 Effects of black rice on the wet weight index of thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

表1 BA对大鼠的胸腺、脾、肝和肾湿重指数的影响(±s，n=6)Tab.1 Effects of black rice on the wet weight index of thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

与对照组比较: 1P＜ 0. 051P＜ 0. 05 vs control group

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表2 BA对大鼠胸腺、脾、肝、肾组织中LDH的影响(±s，n=6)Tab.2 The effects of black rice anthocyanin on the LDH activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

表2 BA对大鼠胸腺、脾、肝、肾组织中LDH的影响(±s，n=6)Tab.2 The effects of black rice anthocyanin on the LDH activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

与对照组比较:1 P＜0.05，2 P＜0.011 P＜0.05，2 P＜0.01 vs control group

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3.3 BA对大鼠胸腺、脾、肝、肾组织中ACP的影响

结果见表3。BA使大鼠脾、肝和肾内的ACP活力显著升高(P＜0.05或0.01)。

3.4 BA对大鼠胸腺、脾、肝、肾组织中SOD的影响

结果见表4。BA组大鼠胸腺、脾、肝中SOD活力都有不同程度的升高(P＜0.05或＜0.01)，但对肾中SOD活力无显著影响。

3.5 BA对大鼠胸腺、脾、肝、肾组织中MDA的影响

结果见表5。BA组大鼠的胸腺、脾中MDA水平都有不同程度的降低(P＜0.05或0.01)，但对肝、肾组织中MDA水平无显著影响。

3.6 BA对大鼠胸腺、脾、肝、肾组织中GSH的影响

结果见表6。BA组大鼠脾、肝、肾中GSH水平都有不同程度的升高(P＜0.05或＜0.01)。

表3 BA对大鼠胸腺、脾、肝、肾组织中ACP的影响(±s，n=6)Tab.3 The effects of black rice anthocyanin on the ACP activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

表3 BA对大鼠胸腺、脾、肝、肾组织中ACP的影响(±s，n=6)Tab.3 The effects of black rice anthocyanin on the ACP activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

与对照组比较:1 P＜0.05，2P＜0.011 P＜0.05，2 P＜0.01 vs control group

组 别 ACP/(u/100mL)胸腺 脾 肝 肾对照组BA低剂量组BA中剂量组BA高剂量组611.6±39.6 581.7±99.6 689.9±123.1 823.7±92.72 615.2±51.9 748.9±79.91 746.5±86.61 788.4±73.62 184.5±18.9 250.9±38.52 347.6±37.72 344.0±54.92 466.8±50.8 665.2±102.42 789.2±68.52 785.2±93.02

表4 BA对大鼠胸腺、脾、肝、肾组织中SOD的影响(±s，n=6)Tab.4 The effects of black rice anthocyanin on the SOD activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

表4 BA对大鼠胸腺、脾、肝、肾组织中SOD的影响(±s，n=6)Tab.4 The effects of black rice anthocyanin on the SOD activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

与对照组比较:1 P＜0.05，2 P＜0.011 P＜0.05，2 P＜0.01 vs control group

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表5 BA对大鼠胸腺、脾、肝、肾组织中MDA的影响(±s，n=6)Tab.5 The effects of black rice anthocyanin on the MDA activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

表5 BA对大鼠胸腺、脾、肝、肾组织中MDA的影响(±s，n=6)Tab.5 The effects of black rice anthocyanin on the MDA activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

与对照组比较:1 P＜0.05，2P＜0.011 P＜0.05，2 P＜0.01 vs control group

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表6 BA对大鼠胸腺、脾、肝、肾组织中GSH的影响结果(±s，n=6)Tab.6 The effects of black rice anthocyanin on the GSH activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

表6 BA对大鼠胸腺、脾、肝、肾组织中GSH的影响结果(±s，n=6)Tab.6 The effects of black rice anthocyanin on the GSH activity in thymus，spleen，liver and kidney of rats(±s，n=6)

与对照组比较:1 P＜0.05，2P＜0.011 P＜0.05，2 P＜0.01 vs control group

组 别 GSH/(mg/mL)胸腺 脾 肝 肾对照组BA低剂量组BA中剂量组BA高剂量组20.36±1.46 19.15±2.87 23.23±3.14 22.65±4.18 7.86±1.45 14.67±2.582 13.71±2.762 14.53±1.372 2.18±0.54 3.33±0.651 5.27±0.992 4.83±0.992 9.15±2.35 12.58±3.151 13.38±2.941 13.33±1.841

4 讨论

胸腺属于中枢免疫器官，具有重要的免疫调节作用，能够分泌多种细胞因子，促进T细胞成熟，在建立自身免疫耐受和维持免疫自稳方面发挥重要作用。脾脏属于外周免疫器官，也具有重要的免疫功能［9］。有学者认为胸腺和脾脏重量指数的改变能够反映机体免疫功能的状态［10-11］。本实验结果表明，不同剂量BA均能使大鼠胸腺和脾脏湿重指数显著提高，表明BA可促进脾脏、胸腺组织细胞生长代谢，改善机体的免疫功能。

ACP、LDH是巨噬细胞激活的标志酶，其活性随着巨噬细胞激活而升高，并随着巨噬细胞的抑制而降低［12-13］。LDH还是细胞内葡萄糖酵解所必需的酶，LDH活性的增强可促进细胞内葡萄糖的酵解，为组织细胞活动以及巨噬细胞的吞噬过程提供相应能量，同时酵解过程中产生的乳酸使巨噬细胞内pH下降，有利于巨噬细胞杀菌。本实验结果表明，不同剂量BA均能使大鼠肝、肾、脾、胸腺等脏器组织中的ACP、LDH活力显著升高，表明BA可增强肝、肾、脾、胸腺等脏器组织的杀菌能力，提高免疫功能。

SOD是超氧自由基清除的关键酶，其活性的变化反映了机体氧化损伤的状况。GSH是体内重要的抗氧化剂，也是抵御自由基损害的重要物质。GSH可清除H2O2，阻断脂质过氧化的连锁反应，保护细胞膜结构和功能完整。当GSH水平下降时，消弱了对自由基损害的防御能力，从而加速了自由基对细胞生物膜系统不饱和脂肪酸的氧化。MDA是生物膜中脂质过氧化产物，其含量随着氧化损伤以及衰老进程的增加而增加，作为组织损伤的一种指标而被广泛应用于抗氧化研究［14］。

本实验中，不同剂量的BA使大鼠肝、脾和(或)胸腺、肾组织中SOD和GSH水平升高，并使胸腺组织中MDA水平下降。表明BA是一种良好的自由基清除剂和(或)抑制剂。BA通过清除组织器官内自由基，维护脏器功能，达到延缓组织器官衰老的作用。由于抗氧化作用(抗衰老)与促免疫调节作用互为因果关系，即抗氧化能力增强了，免疫功能也提高了，反之，免疫功能提高了，抗氧化能力也增强了，因此本实验结果显示BA既有抗氧化作用(抗衰老)又有促免疫调节功能，是与理论分析相符的。

综上所述，BA对机体重要组织器官有良好的保护作用，能增强组织免疫能力，具有一定的免疫调节功能和抗氧化作用，可以作为机体一种良好的食用和辅助药用的免疫调节剂或抗氧化剂。

BA中成分复杂，其中有效活性物质以及作用机制、靶点途径和体内的代谢情况、生物利用度、影响生物活性多因素分析等均有待进一步深入研究证实。本实验未能反映出BA对组织器官免疫功能调节作用和抗氧化功能的剂量效应，这也有待进一步研究。

［1］王艳龙，石绍福，韩 豪，等.中国黑米花色苷研究现状及展望［J］.中国生化药物杂志，2010，31(1):63-66.

［2］Yasujiro M，Kikue K，Toru T，etal，Inhibitory effect of anthocyanins and colored rice on diabetic cataract formation in the rat lense［J］.Inter Congress Series，2002，1245:503-508.

［3］Chen P N，Hsieh Y S，Chiang C L，etal.Silibinin inhibits invasion of oral cancer cells by suppressingthe MAPK pathway［J］.J Dent Res，2006，85:220-225.

［4］Chen P N，Kuo W H，Chiang C L.Black rice anthocynins inhibit cancer cells invasion via repressions of MMPs and u-PA expression［J］.Chem Biolo Interact，2006，163(3):218-229.

［5］钱 松，金丽琴.矢车菊素-3-葡萄糖苷诱导Hela细胞凋亡及其机制的研究［J］.中国生化药物杂志，2008，29(6):369-373.

［6］郭红辉，胡 艳，刘 驰.黑米花色苷对果糖喂养大鼠的抗氧化及胰岛素增敏作用［J］.营养学报，2008，30(1):85-87.

［7］金丽琴，吕建新，杨介钻，等.蝉拟青霉总多糖对大鼠非特异性免疫调节作用的研究［J］.中国病理生理杂志，2001，17(12):1232-1235.

［8］陈秀芳，金丽琴，吕建新，等.蝉拟青霉多糖对大鼠腹腔及肺泡巨噬细胞的激活作用［J］.中国病理生理杂志，2002，18(6):694-697.

［9］梁 锐，李俊莲，李艳彦，等.军蛭煎剂对小鼠胸腺、脾脏重量指数及组织结构影响的实验研究［J］.山西中医学院学报，2008(6):17-18.

［10］寇俊萍.当归芍药散对小鼠免疫功能的影响［J］.中国现代应用药学，2003，20(3):170.

［11］钟 毅.益寿调脂片对小鼠免疫功能的影响［J］.浙江中西医结合杂志，2000，10(8):468.

［12］Schirrmacher V，Bai L，Umansky V，etal.Newcastle disease virus activates macrophages for anti-tumor activity［J］.Int J Oncol，2000，16(2):363-373.

［13］Garcia I，Guler R，Vesin D，etal.Lethal mycobacterium bovis Bacillus-calmette guerin infection in nitric oxide synthase 2-deficient mice:cell-mediated immunity requires nitric oxide synthase 2［J］.Lab Invest，2000，80(9):1385-1397.

［14］王 峰，王晓炜，陶明煊，等.大球盖菇多糖清除自由基活性和对D-半乳糖氧化损伤小鼠的抗氧化作用［J］.食品科学，2009，30(5):233-238.