小刺猴头菌液体深层发酵浸膏多糖HFP及HFA的抗肿瘤活性

苏 玲，李雨婷，宋 慧，吕金超

(吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 130118)

小刺猴头菌［H.caput-medusae(Bull.∶Fr.)Pers］与猴 头 菌 ［Hericium erinaceus(Bull.∶Fr.)Pers］、假猴头菌［H.laciniatum(Leers)Banker］、珊瑚状 猴 头 菌 ［H.coralloides(Scop.∶Fr.)Pers.exGray］同为猴头菌属。从猴头菌属中提取分离得到多糖、甾醇类、萜类、酚类、脂肪酸等多种成分，可用于治疗消化不良、胃溃疡、食道癌、胃癌、十二指肠癌等消化系统疾病［1-2］。

小刺猴头菌与猴头菌外观相似，已有研究多集中于猴头菌子实体或菌丝体化学成分组成、结构分析及药理学活性等方面。对小刺猴头菌的研究报道较少，对其液体深层发酵产物的药理学活性报道更是鲜见。因此，本研究以小刺猴头菌液体深层发酵浸膏多糖为材料，对其抗肿瘤活性作了初步研究，以期补充和丰富对猴头菌属的认识，为更全面、深入地开发小刺猴头菌提供理论依据。

1 材料

小刺猴头菌液体深层发酵浸膏由吉林大学白求恩医大制药厂提供。

S180腹水小鼠购自长春肿瘤研究所;KM小鼠购自吉林大学实验动物中心(动物合格证号:10-1023);人肺腺癌细胞SPC-A-1、人胃癌细胞SGC7901由吉林农业大学生物物理实验室馈赠;人肝癌细胞SMMC7721由吉林农业大学生物制药实验室馈赠。

RPMI 1640(Gibco);新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);胰蛋白酶、MTT(Amresco);注射用环磷酰胺(上海华联制药有限公司);DMSO(天津市北联精细化学品开发有限公司);链霉素、青霉素(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)。

TS100倒置显微镜(Nikon);DG5032酶标仪(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司);CO2恒温培养箱(德国贺利氏公司)。

2 方法

2.1 小刺猴头菌发酵浸膏多糖HFP和HFA的提取

小刺猴头菌发酵浸膏经95%乙醇浸泡过夜脱脂，去除乙醇，加3倍体积水溶解，80℃水浴提取3 h，去除不溶物，冷却，加入95%乙醇至终浓度75%，4℃过夜，离心分离沉淀及上清液，浓缩干燥即为HFP和HFA。

2.2 体外抗肿瘤实验

对数生长期的肿瘤细胞以1×105/mL的密度接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，设空白对照孔、正常对照孔及不同药物浓度试验孔，同时设颜色对照孔，每组设6个平行孔，放入37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h后，吸弃上清，在药物试验孔中分别加入药物浓度为15.625，31.25，62.5，125，250，500，1 000，2 000 μg/mL 的培养液200 μL，正常对照孔只加细胞和培养液，颜色对照孔不加细胞只加含不同浓度药物的培养液，空白对照组不加细胞只加培养液，于培养箱中培养44或68 h，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，37℃孵育4 h后弃去孔内溶液，每孔加入DMSO 150μL轻度振荡10 min使沉淀完全溶解，用酶标仪在570 nm波长测定吸光度(A)值，并设630 nm为参考波长。实验重复3次，计算抑制率(IC)。IC=1 － (A药物－ A颜色对照)/(A正常对照－A空白对照)×100%。

2.3 HFP体内抗肿瘤实验

2.3.1 分组及给药 KM鼠80只，雌性，随机分为8组，每组10只，即模型对照组、阳性对照组、低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组、低剂量预防组、中剂量预防组和高剂量预防组。接种S180肉瘤细胞前5 d，低、中、高预防组分别按小鼠每千克体重灌服50，100 和200mg HFP，0.4mL/只，连续5 d，1次/d;其余5组灌服生理盐水0.4mL/只，连续5 d，1次/d。实验第6天灌胃前，无菌抽取腹腔注射S180肉瘤细胞7d的小鼠腹水，经无菌生理盐水洗涤，1 000 r/min离心5 min，重复2次。生理盐水重悬，台盼兰染色，显微镜下计数活细胞数。调整细胞浓度为1×107/mL，混匀，每只小鼠右前肢腋下皮下注射0.2mL。接瘤后，低、中、高预防组分别按前述给药方式、剂量继续灌服HFP 10 d;低、中、高治疗组分别灌服HFP 50，100和200mg/kg;阳性对照组灌服CTX 100mg/kg;模型对照组灌服生理盐水;灌胃体检均为0.4mL/只，均连续给药15 d，1次/d。

2.3.2 S180肉瘤荷瘤小鼠体重、瘤重、抑瘤率及脾指数和胸腺指数的测定各组实验动物自由摄食饮水，于给药第1，5，10，15 天，称量并记录体重。末次给药24 h后，断颈处死小鼠。处死前称量各组小鼠体重并记录，完整剥取右上肢瘤体，称重并记录，并按下列公式计算抑瘤率。同时摘取小鼠脾脏和胸腺，分别称重并计算脾系数和胸腺系数。

2.4 数据处理

3 结果

3.1 体外抗肿瘤实验

结果见图1。浓度在15.625～2 000μg/mL的HFP和HFA对SMMC7721、SPC-A-1、SGC7901的作用大体呈剂量依赖关系，但HFP的作用效果好于HFA。长时间作用普遍好于短时间作用效果。其中HFP作用SPC-A-1 72 h时对癌细胞的抑制率达70.5%。

3.2 体内抗肿瘤实验

3.2.1 HFP对S180荷瘤小鼠体重的影响 结果见表1。实验第5天CTX组及低、中、高剂量HFP预防组小鼠体重略有下降，与模型对照组比较有极显著差异(P＜0.01)。实验第10天，低、中、高剂量HFP预防组小鼠体重已恢复至模型对照组水平，无统计学差异(P＞0.05);CTX组体重略有回升，但与模型对照组比较差异仍为极显著(P＜0.01)。至实验最后1 d处死小鼠前称重结果显示，CTX组体重仍未恢复至模型对照组水平，统计学差异极显著(P＜0.01)。同时，低剂量HFP治疗组小鼠体重与模型对照组比较，达极显著差异水平(P＜0.01)。

图1 HFP和HFA对人肝癌细胞SMMC7721(A)、人肺腺癌细胞SPC-A-1(B)、人胃癌细胞SGC7901(C)的抑制率Fig.1 The inhibition ratio of HFP and HFA to SMMC7721(A)、SPC-A-1(B)、SGC7901(C)

表1 S180荷瘤小鼠体重、瘤重和抑瘤率(n=10，±s)Tab.1 The body weights，tumor weights and inhibition rates of S180 mice(n=10，±s)

表1 S180荷瘤小鼠体重、瘤重和抑瘤率(n=10，±s)Tab.1 The body weights，tumor weights and inhibition rates of S180 mice(n=10，±s)

与模型对照组比较:1 P＜0.01;与阳性对照组比较:2 P＜0.01Compared with model control group:1 P＜0.01;Compared with CTX group:2 P＜0.01

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3.2.2 瘤重及抑瘤率 结果见表1。所有给药组小鼠瘤重与模型对照组比较均达极显著差异水平(P＜0.01)。至实验最后1 d处死小鼠时，中、高剂量预防组小鼠腋下无肉瘤生长，即抑制肿瘤发生率为100%。HFP治疗组对肿瘤的生长抑制作用随给药剂量增大而变强，抑瘤率由40%上升至86.6%，但仍显著低于同等给药剂量HFP预防组。此外，高剂量治疗组和低剂量预防组的抑瘤率(86.6%和88.6%)，与CTX 组的88.7%比较，无统计学差异(P ＞0.05)。

3.2.3 胸腺系数及脾系数 各组S180荷瘤小鼠胸腺及脾系数见表2。CTX组的脾系数和胸腺系数与模型对照组比较均达极显著差异水平(P＜0.01)。3个剂量的HFP预防组脾系数与模型对照组比较差异显著(P＜0.05)，其中低剂量预防组差异达极显著(P＜0.01)。3个HFP治疗组脾系数的大小与给药剂量呈正相关，且均高于HFP预防组，但无统计学意义(P＞0.05);而胸腺系数则随给药剂量的升高而降低。HFP预防组的胸腺系数有随给药剂量增大而升高的趋势。

4 讨论

肿瘤是一种严重威胁人类健康和生命的常见病和多发病。一直以来，对于真菌多糖类物质的抗癌机制的认识主要集中于增强机体免疫力，如提高巨噬细胞吞噬活性、增强NK细胞杀伤作用、促进免疫球蛋白的形成等作用［3-5］，间接地抵制肿瘤的发生、转移、恶化。从本实验所得结果可以推测，HFP和HFA对体外培养的肿瘤细胞的抑制率高低与细胞种类有关，其抗瘤活性具有选择性和特异性，即其可靶向作用于某些肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞正常生长。HFP和HFA表现出的体外抗肿瘤活性，可能是其特定的空间构象与细胞膜表面的特异性受体识别并结合(如死亡受体，Fas等)，从而诱导凋亡基因表达、激活凋亡酶，最终导致肿瘤细胞死亡［6］。

表2 S180荷瘤小鼠胸腺系数及脾系数(n=10，±s)Tab.2 The coefficient of thymus and spleen(n=10，±s)

表2 S180荷瘤小鼠胸腺系数及脾系数(n=10，±s)Tab.2 The coefficient of thymus and spleen(n=10，±s)

与模型对照组比较:1 P＜0.05，2 P＜0.01Compared with model control group:1 P＜0.05，2 P＜0.01

组 别 剂量/(mg/kg)胸腺系数/(mg/g)脾系数/(mg/g)模型对照组 － 3.386±0.475 11.224±3.239阳性对照组 100 1.026±0.2722 3.026±1.4502低剂量治疗组 50 3.710±0.756 8.410±3.344中剂量治疗组 100 3.603±0.648 9.716±2.450高剂量治疗组 200 3.190±0.600 11.264±3.278低剂量预防组 50 3.631±0.587 7.429±2.1091中剂量预防组 100 3.700±0.693 8.247±1.0701高剂量预防组 200 3.979±0.876 5.614±0.9682

另外，真菌糖类物质多样的生物学活性与其空间立体结构密不可分，而其空间构型取决于其单糖组成，连键方式，分子质量大小等一级结构。现有的研究认为，具有生物活性的真菌多糖多为β(1→3)连接的主链和β(1→6)连接的葡聚糖。丁剑［7］研究报道:小刺猴头菌深层发酵液多糖HMP的结构为{-(1→4)Glu］3-(1→6)Glu}n-，而本实验所用发酵浸膏为发酵液和发酵菌丝体的混合物，提取所得的两种多糖的单糖组成及结构等还有待进一步研究。

［1］宋 慧.猴头菌化学成分研究及菌种筛选［D］.长春:吉林农业大学，2003.

［2］王晓玉，蒋秋燕，凌沛学，等.猴头菌活性成分及药理作用研究进展［J］.中国生化药物杂志，2010，31(1):70-72.

［3］王月颖，刘正国，李兴玉.梁金菇多糖诱导K562细胞凋亡的研究［J］.中国中药杂志，2004，29(12):1170-1173.

［4］任大明，杜志强，李秀娜，等.猴头菌丝多糖免疫调节与抗氧化功能研究［J］.沈阳农业大学学报，2007，38(3):370-374.

［5］聂继盛，祝寿芬.猴头多糖抗肿瘤及对免疫功能的影响［J］.山西医药杂志，2003，32(2):107-109.

［6］樊黎生.黑木耳多糖AAP-IIa级分的制备及其生物活性的研究［D］.武汉:华中农业大学，2006.

［7］丁 剑.猴头菌属猴头菌种不同菌株发酵液多糖的分离纯化与结构研究［D］.长春:吉林农业大学，2008.