HPLC测定钩藤药材中钩藤碱、异钩藤碱的含量

童宏龙刘英波李江黄文荣谭怀美

1.贵阳中医学院药学院，贵州贵阳550002;2.遵义医药高等专科学校药学系，贵州遵义563000;3.贵州百花医药股份有限公司，贵州遵义563000

HPLC测定钩藤药材中钩藤碱、异钩藤碱的含量

童宏龙1刘英波2李江1黄文荣3谭怀美2

1.贵阳中医学院药学院，贵州贵阳550002;2.遵义医药高等专科学校药学系，贵州遵义563000;3.贵州百花医药股份有限公司，贵州遵义563000

目的:用HPLC法建立钩藤药材中钩藤碱(Rhynchophylline)、异钩藤碱(Isorhynchophylline)的含量测定方法，用于钩藤药材的质量控制。方法:色谱柱为Diamonsil C18柱(4．6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇:水=65:35(V/V，含0.01mmol/L三乙胺，冰醋酸调PH7.0)为流动相，流速为1.0 ml·min－1，在245nm检测波长下，测定钩藤药材中钩藤碱、异钩藤碱含量。结果:钩藤碱及异钩藤碱的回归方程分别为Y=1.0E+6x－21142和Y=1.1E+6x－13566，线性范围分别为0.254～1.524 μg和0.216～1.296 μg，相关系数分别0.9999和0.9999。结论:本法正确、简便、快速，对于控制和评价钩藤药材的品质有重要意义。

钩藤;高效液相色谱法;钩藤碱;异钩藤碱

钩藤为茜草科植物钩藤Uncaria rhynchophylla(Miq.)Miq.Ex Havil、大叶钩藤Uncaria macrophylla Wall.、毛钩藤Uncaria hirsuia Havil.、华钩藤Uncaria sinensis(Oliv.)Havil或无柄果钩藤Uncaria sessilifrucius Roxb.的干燥带钩茎枝。钩藤具有息风定惊，清热平肝的作用，用于肝风内动，惊痫抽搐，感冒夹惊，小儿惊啼，妊娠子痫，头痛眩晕［1］。钩藤的茎枝中含有多种吲哚类生物碱，主要有效成分为钩藤碱和异钩藤碱，此外还含有金丝桃苷、儿茶素等酚性成分［2］。宋纯清等［3］研究表明降压作用异钩藤碱(42.0%)＞钩藤碱(32.1%)＞钩藤总碱(21.3%)＞钩藤非生物碱(12.4%)。

我国对钩藤药材的研究已经有好几十年的历史了。虽然钩藤相关的文献有很多，包括钩藤中化学成分的研究、生物碱的研究、药理的研究、毒理的研究等等，高效液相色谱法测定钩藤中钩藤碱、异钩藤碱的含量也有一定研究，但是相关文献经实验结果较难重复，可能跟药材的多样性有关。《中国药典》2010版关于钩藤的部分也没有收录HPLC法测定钩藤中钩藤碱、异钩藤碱含量等相关内容。本文以钩藤碱、异钩藤碱为指标，利用HPLC法进行含量测定，建立相关质量标准研究，为后续研究提供相关信息。

1 仪器与试药

岛津LC－20AT高效液相色谱仪、DAD紫外检测器、威玛龙色谱工作站、AE/240型电子天平(上海梅特勒仪器有限公司)、AVY 220型电子天平(日本岛津)、SK 8210 HP型超声波清洗机(上海科导仪器有限公司)。

钩藤碱对照品(南昌贝塔生物科技有限公司，批号:10525－200912，供含量测定用，含量≥98%)、异钩藤碱对照品(南昌贝塔生物科技有限公司，批号:10172－200912，供含量测定用，含量≥98%)、钩藤药材(采自贵州省开阳县钩藤种植基地，经贵阳中医学院生药教研室刘芃老师鉴定为茜草科植物钩藤Uncaria rhynchophylla(Miq.)Miq.Ex Havil。乙醇(食用酒精，95%)、三乙胺(重庆金山化学试剂有限公司，批号:080708)为分析纯，甲醇(天津市福晨化学试剂厂，批号:20090520)为色谱纯，水为娃哈哈纯净水(贵阳哇哈哈昌盛饮料有限公司，批号13156Y)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱:Diamonsil－Cl8(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相:甲醇:水=65:35(V/V，含0.01mmol/L三乙胺，冰醋酸调PH7.0);检测波长:245nm;柱温:30℃;流速:1 mL?min－1;进样量:10 μL;灵敏度:1.0 AU。

2.2 对照品溶液的制备精密称取对照品钩藤碱1.27 mg、异钩藤碱1.08mg加80%甲醇溶解，定容至10 mL量瓶，即得钩藤碱、异钩藤碱混合对照品供试液，其中钩藤碱为0.127mg/ml、异钩藤碱为0.108mg/ml。

2.3 供试品溶液的制备将样品粉碎，过一号筛。精密称取9.9934 g，置250ml锥形瓶中，加入100ml 80%的乙醇液，混匀，浸泡1h，超声处理20 min，过滤，连续2次。合并提取液，水浴(50℃)蒸干，用80%甲醇定容至10 mL量瓶中，即得供试品溶液。

2.4 线性关系考察精密吸取混合对照品溶液2，4，8，10，12，16 μL。分别以钩藤碱、异钩藤碱进样量为横坐标(X)，以峰面积积分值A为纵坐标(Y)，进行线性回归，得钩藤碱回归方程为:Y=1.0E+6x－21142(r=0.9999)，结果表明钩藤碱在0.254～1.524μg有良好的线性关系;异钩藤碱回归方程为:Y=1.1E+6x－13566，(r=0.9999)，结果表明异钩藤碱在0.216～1.296μg有良好的线性关系。

2.5 精密度试验精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样5次，分别记录钩藤碱、异钩藤碱峰面积值，RSD值分别为2.97%和2.69%，结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验精密吸取样品溶液10 μL，分别于0，2，4，8，12，24 h，进样，分别测定钩藤碱、异钩藤碱峰面积值。RSD值分别为1.56%和1.27%，说明指标成分在24h内比较稳定。

2.7 重复性试验取同一批次钩藤6份，分别用2.3项下方法制备得供试品溶液，并按上述色谱条件操作，分别测得样品中钩藤碱、异钩藤碱含量，RSD值分别为1.07%和1.17%，说明测量方法的重复性良好。

2.8 加样回收试验取同一批次钩藤6份，分别置烧瓶中，分别精密加入浓度为0.1990 mg·mL－1的钩藤碱对照液1mL和浓度为2.2335mg·mL－1的异钩藤碱对照液1mL，分别用1.4项下方法制备得供试品溶液，测得样品中钩藤碱、异钩藤碱的含量。钩藤碱、异钩藤碱平均回收率分别为99.69%、102.22;RSD值分别为1.51%和1.09%，说明所建立的方法加样回收率较高，结果见表1、表2。

表2 异钩藤碱加样回收率测定结果

2.9 样品中钩藤碱、异钩藤碱含量测定分别称取7份钩藤样品按2.3项下制备，精密吸取对照品与供试品溶液各10μL，照上述方法测定，本次实验中所用钩藤中钩藤碱、异钩藤碱含量分别为0.01910mg·g－1、0.2320mg·g－1，见图1。

图1 钩藤中钩藤碱、异钩藤碱HPLC

3 讨论

3.1 色谱条件的选择张荣等［4］研究表明以甲醇∶水=70∶30(V/V，含0.01mmol/L三乙胺，冰醋酸调PH7.0)为流动相时，钩藤碱与异钩藤碱能达到良好分离且峰形较好。在本研究所用钩藤药材测定时发现，由于钩藤碱、异钩藤碱中间有一物质峰，原流动相不能使三者较好分离，故将流动相调整为甲醇∶水=65∶35(V/V，含0.01mmol/L三乙胺，冰醋酸调PH7.0)。

3.2 提取方法和溶剂的选择文献表明［5］钩藤在煎煮过程中成分会发生变化。钩藤碱、异钩藤碱均热不稳定，所以采用超声连续提取。选用不同浓度乙醇作为提取溶剂，实验结果表明80%乙醇提取率较高，故本文选择80%乙醇作为提取溶剂。

3.3 预实验及实验相关问题本研究预实验时发现，配置的钩藤碱对照品溶液一周后重新测定，对比原测定图谱发现，钩藤碱基本稳定，但在异钩藤碱岀峰处多出一峰，含量较小，怀疑钩藤碱少许转化为异钩藤碱，这与原田正敏［6］研究结果一致。但异钩藤碱测定后对比原测定图谱发现，异钩藤碱在甲醇中不稳定。在异钩藤碱峰后面出现一个与异钩藤碱含量相当的峰，依据相关文献［7］中钩藤总生物碱分离顺序估计为异去氢钩藤碱。但是钩藤碱、异钩藤碱在甲醇中24小时内含量较稳定，故以钩藤碱、异钩藤碱含量来评价钩藤药材质量是可行的。

综上所述，本研究方法正确、简便、快速，对于控制和评价钩藤药材的品质有重要意义。

［1］中国药典(一部)［S］．2010:240．

［2］姜伟，张丽．钩藤的药理作用研究［J］．现代中西医结合杂志，2006，15(21):3013．

［3］宋纯清，樊懿，黄伟晖，等．钩藤中不同成分降压作用的差异［J］．中草药，2000，31(10):7621．

［4］张荣，刘睿，刘启德，等．钩藤中钩藤碱、异钩藤碱的提取与含量测定［J］．中药新药与临床药理，2009，20(4):338～341．

［5］黄卓谦，刘建利，王玉英，等．钩藤煎煮过程中化学成分变化的研究［J］．西北大学学报，2008，38(5):787～789．

［6］原田正敏．日本常用中药的定量分析—防己、钩藤［J］．国外医药植物药分册，1991，6(5):219．

［7］郑嘉宁，王定勇．大叶钩藤生物碱类化学成分研究［J］．中国药导报，2009，15(1):80．

The study of the content determination of Rhynchophylline and Isorhynchophylline in Uncaria Rhynchophylla by HPLC

TONG Hong－long，LI Jiang，HUANG Wen－rong
1.GuiYang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China;2.Guizhou Baihua Pharmaceutical Co.，Ltd.，Zunyi 563000，China

Objective:To determine the contents of Rhynchophylline and Isorhynchophylline in Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jacks.by the method of HPLC.Methods:Contents of the isoflavones(Rhynchophylline and Isorhynchophylline)in Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jacks.was measured by HPLC［a column of Diamonsil Cl8(4.6 mm×250 mm，5 um)，methanol:water=65:35(V/V，with 0.01mmol/L triethylamine，glacial acetic acid adjusted PH7.0)as the mobile phase，flow rate 1.0 mL·min－1，detective wave 245 nm］to determine the contents of Rhynchophylline and Isorhynchophylline．Results:The two regression equations are Y=1.0E+6x－21142 and Y=1.1E+6x－13566，and have good linearity in the range of 0.254～1.524 ug and 0.216～1.296 ug，r=0.9999 and 0.9999 respectively.Conclusion:The method is correct，simple，rapid，it is vital for controlling and evaluating the quality of Chinese medicine Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jacks.

Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jacks.;HPLC;Rhynchophylline;Isorhynchophylline

R927.2

A

1007－8517(2012)18－0056－02

国家“重大新药创制”科技重大专项—钩藤降压缓释制剂的研制。

刘英波(1979－)，男，苗族，贵州天柱人，硕士，主要从事中药—民族药新制剂与新剂型研究。E－mail:gzliuyb@126．com。

2012.07.29)