中药靛玉红对膀胱癌细胞株的生长抑制作用观察

曹 婧 侯晨辉

郑州铁路职业技术学院，河南郑州 450052

中药靛玉红对膀胱癌细胞株的生长抑制作用观察

曹 婧 侯晨辉

郑州铁路职业技术学院，河南郑州 450052

目的探讨靛玉红对膀胱癌细胞株的生长抑制作用。方法体外持续传代培养已加有不同浓度靛玉红的膀胱癌细胞株30d，记录各组各代细胞的增殖周期；MTT法测定不同浓度不同作用时间的靛玉红对细胞株的生长抑制作用。结果不同浓度的靛玉红均能抑制细胞株生长，并呈明显的量效关系和时间依赖性。结论靛玉红能够明显抑制膀胱癌细胞株增殖，且具有量效关系和时间依赖性。

靛玉红；膀胱癌；生长抑制

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤[1]，我国膀胱癌发病率居泌尿系统肿瘤第一位，其中90%以上为膀胱移行细胞癌。目前临床上对膀胱癌采用的主要治疗方法是手术切除，术后化疗，必要时放疗。但膀胱癌总体来说复发率较高。目前临床工作者和研究者均认为，从中药中寻找新的抗肿瘤药物已成为发展方向。靛玉红是我国创制的治疗慢性粒细胞白血病的有效药物，它是治疗慢性粒细胞白血病的有效成分，由传统中药青黛中提取。其抗肿瘤作用原理主要为抑制DNA聚合酶，影响DNA的聚合过程，从而使DNA合成受抑制。本实验将不同浓度的中药靛玉红作用于膀胱癌细胞株，观察其对膀胱癌细胞株的生长抑制作用，并进一步观察其是否具有量效关系和时间依赖性。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

RPMI1640培养液、二甲基亚砜（DMSO）、甲基四唑蓝、胰蛋白酶、靛玉红粉剂(用前靛玉红需经DMSO溶解，需用不同浓度时，加RPMI1640培养液稀释)、胎牛血清。膀胱癌细胞株。

1.2 实验分组

实验组：靛玉红在培养液中终浓度分别为1μmol/L、5μmol/L、10 μmol/L，传代后即加加入含有不同浓度药物的培养液；对照组：药物终浓度为0，持续传代培养。

1.3 按常规方法细胞培养膀胱癌细胞株

体外培养，在37℃，5%CO2的培养箱内培养：RPMI1640培养液中含有链霉素、青霉素100u/mL、10%胎牛血清及靛玉红，其浓度分别为 0、1、5、10 μmol/L，持续传代培养一个月（30d），记录每组中每一代细胞的增殖周期。

1.4 细胞生长抑制试验（MTT试验）

以0.5%的胰蛋白酶消化将处于对数生长期、未加药的膀胱癌细胞，用RPMI1640培养液（内含链霉素、10%胎牛血清及青霉素100u/ml）制成细胞数为2×104的细胞悬液并接种于96孔培养板，按试验要求在培养24h后，分别在细胞中加入药物靛玉红。终浓度分别为 0、1μmol/L、5 μmol/L 、10 μmol/L，每组 5 复孔，并设置空白对照组。 置于 37℃，5%CO2的培养箱内，培养 12、24、48h、72h后取出，加入20μL5mg/mL的MTT在每孔内，然后作用4h于37℃，5%CO2培养箱中。吸取各孔内上清弃去，每孔加入DMSO150 μL，振荡10min。最后在波长570nm下用BIO-RAD Model 680酶标仪测定各组的吸光度A值。细胞生长抑制率（%）=（对照组吸光度A值-实验组吸光度A值）/对照组吸光度A值×100%。

1.5 统计学处理

统计学软件采用SPSS 13.0进行处理，进行单因素方差分析，组间比较用t检验，数据以（±s）表示，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖周期的变化

在细胞培养的一个月内，对照组传代并收集了9代细胞，靛玉红浓度为 1μmol/L组共8代细胞、5 μmol/L组共 5代细胞、10 μmol/L组则只传代并收集了2代细胞。在同一组内部，后一代的细胞比前代细胞达到传代标准所需的时间也逐渐延长。这说明随着靛玉红浓度的增加，作用时间的延长，膀胱癌细胞株的增殖周期也明显延长。见图1。

图1 靛玉红对Scaber细胞增殖周期的影响

2.2 细胞生长抑制试验（MTT试验）

活细胞特别是增殖细胞可将外源性MTT代谢成难溶的紫蓝色沉淀，其数量与增殖程度成正比，而死的细胞则不能如此。二甲基亚砜（DMSO）能够溶解细胞中的紫蓝色沉淀，用酶标仪测定各组的吸光度A值，可以间接反映活细胞的数量。细胞生长抑制率（%）=（对照组吸光度A值-实验组吸光度A值）/对照组吸光度A值×100%。结果说明随着靛玉红浓度增加、作用时间延长，膀胱癌细胞株的生长抑制率也明显增加。见表1。

表1 靛玉红对膀胱癌Scaber细胞株的生长抑制作用（±s）

表1 靛玉红对膀胱癌Scaber细胞株的生长抑制作用（±s）

各组间生长抑制作用有差异（P＜0.05）

药物浓度（μmol∕L）细胞生长抑制率（%）12h 24h 48h 72h 151 0 6.72±1.84 10.79±2.11 16.51±1.16 10.27±3.94 15.58±1.27 23.55±2.73 15.77±2.71 27.82±3.07 33.63±2.81 23.40±2.96 31.09±4.39 41.96±4.77

3 讨论

泌尿系统恶性肿瘤中，膀胱癌是最常见的。由于其术后辅助治疗疗效不甚理想，目前各国研究者都在寻找新的、有效的抗膀胱癌细胞增殖的药物。中药来源天然，毒副作用较少，从中药中寻找新的抗肿瘤药物已成为许多研究者的共识。中药靛玉红是传统药物，由我国创制，主要用于治疗白血病，尤其对慢性粒细胞白血病有明显疗效。其主要优点在于中药毒副作用较小，且无明显骨髓抑制作用。在缩小脾脏和降低白细胞方面较白消安好。其作用原理主要为抑制DNA聚合酶，影响DNA聚合过程，从而使DNA合成受抑制。除此之外，能够提高机体免疫功能也可能是其抗癌机制之一。

近年来的研究显示，靛玉红抑制肿瘤生长及肿瘤细胞的DNA合成是通过抑制肿瘤生长所必需的蛋白激酶发挥作用的，包括CDKS、Src等。其主要通过以下三种途径抑制肿瘤细胞生长：①靛玉红及其衍生物竞争性拮抗CDK的ATP结合位点，阻断细胞周期。②靛玉红及其衍生物抑制Src激酶，阻断Stat3信号传导通路，致使由Stat3磷酸化激活的抗细胞程序性死亡的转录蛋白增加的过程受到抑制，从而使癌细胞发生程序性细胞死亡。③靛玉红及其衍生物抑制核苷酸转运蛋白，抑制核苷酸的吸收，从而抑制肿瘤细胞增殖。除此之外，靛玉红还有可能通过抑制成纤维细胞生长因子受体（FGFR）来抑制肿瘤细胞生长[2]。目前靛玉红主要用于对慢性粒细胞白血病的治疗，对实体瘤细胞的抑制作用研究进行得较少。

本实验细胞培养结果显示，在一定的时间内（细胞培养时间为30d），各组传代次数逐渐减少。对照组（不加药）共传代并收集了 9代细胞，1μmol/L组共 8代细胞，5 μmol/L组共 5代细胞，而靛玉红浓度最大组（10 μmol/L组）只有两代细胞；同一实验组内，增殖周期随作用时间增加也逐渐延长。对照组稳定在3～3.5d传代一次；1μmol/L组（A组）最初3d传代一次，至第八代细胞时渐增至近 5d；5 μmol/L组（B组）由第一代细胞的经 4d传代增至第五代细胞的8d；而10 μmol/L组（C组）的细胞第一次传代历经8d，第二次12d，其后直至规定的细胞培养时间结束（共 30d），也未达到传代标准，只收集到两代细胞。MTT结果显示，靛玉红作用于Scaber细胞株同一时相如24h时，当药物浓度由1μmol/L上升至 10 μmol/L时， 细胞生长抑制率由 （10.27±3.94）%上升至（23.55±2.73）%； 而药物浓度相同如 5 μmol/L时， 分别作用 12、24、48、72h， 细胞生长抑制率则为（10.79±2.11）% 、（15.58±1.27）%、（27.82±3.07）%、（31.09±4.39）%。 组间差异有显著性（P＜0.05）。这表明，靛玉红的浓度越大，作用时间越长，其对细胞增殖抑制的效果就越显著。因此，本实验结果显示，靛玉红具有体外抗膀胱癌作用，且具有时间和剂量依赖性。其对膀胱癌的抑制作用机制，有待进一步研究。

[1]周际昌.实用肿瘤内科学[M].北京：人民卫生出版社,2005：351-352

[2]Zhen Y,Srensen V,Suo Z ，et al.Oncogene,2007,26：6372-6385.

R97

A

1672-5654（2012）07（a）-0168-02

2012-06-15）