牛奶中三聚氰酸残留检测方法的研究

陈福华 隆雪明 易建希 谭美英 周玉洁 （农业部畜禽产品质量监督检验测试中心 湖南 长沙 410006）



牛奶中三聚氰酸残留检测方法的研究

陈福华 隆雪明 易建希 谭美英 周玉洁 （农业部畜禽产品质量监督检验测试中心 湖南 长沙 410006）

用高效液相色谱法，226nm为检测波长，乙腈作提取液，5mmol/L四丁基溴化铵和5mmol/L磷酸氢二钠溶液(1:1)作水相(pH为7.0)，乙腈作有机相，水相:有机相=91:1，测定进行牛奶中三聚氰酸残留量。结果表明，其检出线为0.5mg/kg；在0.5~50mg/kg范围内，呈线性关系，相关系数r为0.9998；添加浓度为2.0mg/kg、4.0mg/kg、8.0mg/kg的条件下，三聚氰酸的残留回收率在73.5%~99.6%之间，组内、组间变异系数小于10%，均达到了欧盟和我国残留检测的相关规定。

牛奶 三聚氰酸 液相色谱法 检测

三聚氰酸(Cyanuric acid，CYA)，又名氰尿酸，异氰脲酸，是略有苦味的无色无臭晶体，分子式：C3H3N3O3，分子量：129.07，分子结构如下：

该物质溶于热水、热醇、吡啶、浓盐酸及硫酸而不分解，溶于氢氧化钠和氢氧化钾水溶液，不溶于冷醇、醚、丙酮、苯和氯仿。三聚氰酸作为重要的化工原料，常用作高分子材料合成前体、材料粘合剂以及杀菌消毒剂。2007年3月，美国的猫、狗中毒事件[1]，2008年9月国内的“毒奶”事件，都与三聚氰酸有莫大的关系。通过对毒宠物饲料分析发现，其含有5.3%三聚氰酸[2]。经亚慢性口毒性研究显示，三聚氰酸造成肾组织损伤，包括肾小管扩张、肾小管上皮坏死或增生、嗜碱性肾小管增加、中性粒细胞浸润、矿化和纤维化。进一步研究发现，三聚氰酸易致泌尿系结石，最终引起肾功能损害。

调查发现，三聚氰酸进入牛奶大致有四个途径：其一，人为添加；其二，饲料中的三聚氰酸；其三，包装材料中的三聚氰酸；其四，生产设备中的三聚氰酸。前两个途径往往会使三聚氰酸在牛奶中大量残留，而后两种途径的残留量是极低的。

1 材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器；分析天平：感量0.00001g和0.001g；固相萃取装置；旋涡混匀器；离心机；超声波清洗机；氮吹仪；pH计：精度为0.02；微孔滤膜：0.22μm，有机膜；SPE柱：阴离子固相萃取柱，60mg/3 ml。

1.2 试剂和试液 乙腈、甲醇、甲酸，色谱纯；正己烷、四丁基溴化铵、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氨水为分析纯；5%氨水水溶液：将5ml氨水与95ml水混合均匀，得到5%氨水水溶液，使用前配制；缓冲溶液：分别称取四丁基溴化铵、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠0.537g、0.596g、0.260g，加水溶解后定容到1L，用1mol/L的氢氧化钠调pH至7.0；4%甲酸甲醇溶液：将4ml甲酸与96ml甲醇混合均匀；乙腈水溶液：将80ml乙腈与20ml水混合均匀即得。

1.3 标准物质 三聚氰酸，纯度大于98.0%；标准储备液的配制：称取三聚氰酸标准品0.01g(精确到0.00001g)置于10ml容量瓶中，加乙腈水溶液超声溶解并定容，配制成浓度为1.0mg/ml的标准储备液。4℃下避光保存；标准工作液的配制：准确移取适量三聚氰酸标准储备液，用流动相配成0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0mg/ml的标准工作液。

2 试验方法

2.1 试验方法 称取试样2g(精确到0.001g)，置于50ml离心管中，加入8ml乙腈，涡旋混合，超声提取10min，静置，离心5min(5000r/min)。取全部上清液置另一离心管，加入5ml正己烷，涡旋混匀2min，离心5min(5000r/min)，去上层液，氮气吹至近干，用5ml 5%氨水水溶液溶解。将SPE柱依次用甲醇5ml、5%氨水水溶液5ml活化，将提取液过柱，依次用5%氨水水溶液3ml、甲醇3ml淋洗，抽干，用4%甲酸甲醇溶液5ml洗脱，收集洗脱液，50℃水浴，氮气吹干。用流动相1.0ml溶解残留物，过0.22mm微孔滤膜，供高效液相色谱分析。

2.2 色谱条件 色谱柱：C18柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：缓冲溶液:乙腈=91:9；流速：1.0ml/min。进样量：20.0ml；检测波长：226nm。

3 结果

试验结果表明，该方法操作简单，按信噪比大于3计算，求得该方法三聚氰酸的检测限为0.5mg/kg，达到了残留检测的相关规定。为验证此方法的准确性、精密度和重现性，在空白牛奶中分别添加2.0mg/kg、4.0mg/kg、8.0mg/kg三聚氰酸三个浓度水平，每个水平设五个平行，并设空白对照。按样品前处理方法处理后进行HPLC分析，根据各组的峰面积计算其浓度和回收率。

试验结果表明：在空白牛奶中添加2.0mg/kg、4.0mg/ kg、8.0mg/kg三聚氰酸三个浓度水平，测得的回收率分别在：73.5%~97.9%(81.3±3.5)，77.8%~97.5%(83.8±1.8)，77.2%~99.6%(90.1±5.5)，批内变异系数分别为：3.6%~ 8.8%、3.6%~8.9%、4.4%~7.2%；批间变异系数分别为：4.3%、2.2%、6.1%，均小于10%，均达到了欧盟和我国残留检测方法的相关要求，表明该方法稳定性、精密度、重现性好，能满足牛奶中三聚氰酸分析的要求。

4 讨论

4.1 提取溶剂的选择 三聚氰酸溶于热水、热乙醇、吡啶、浓盐酸及硫酸，也溶于氢氧化钠和氢氧化钾水溶液，不溶于冷乙醇、醚、丙酮、苯和氯仿。1g能溶于约200ml水中。用乙腈水(1:1)、乙腈水(4:1)、甲醇、甲醇水、酸化甲醇、二乙胺：水：乙腈(1:4:5)、二乙胺：水：乙腈(1:2:7)等提取，通过试验比较各种溶剂的回收率。发现，乙腈水(4:1)与二乙胺:水:乙腈(1:2:7)均能较好的提取牛奶中的三聚氰酸，但二乙胺刺激性大，危害高，且一般实验室没有此条件；故用乙腈直接提取，除杂效果好、操作方便、快捷。

4.2 去脂肪 牛奶中含有大量蛋白和脂肪，用乙腈可以去除部分的蛋白与脂肪。试验中发现，用乙腈直接提取过阴离子SPE柱，会严重的影响柱保留。为进一步去除杂质，把提取液用氮气吹至近干，用氨水水溶液溶解，乙腈饱和正己烷去脂去杂，再过SPE小柱，可提高回收率。

4.3 固相萃取柱的选择 用乙腈提取目标化合物时，提取液中还含有一定量脂肪和蛋白质。采用常规方法，即正己烷除脂肪，有一定的效果，但依然有许多杂质存在，故应选择合适的固相萃取小柱除去脂肪和水溶性杂质。

根据文献报道与SPE小柱特性，分别采用普通C18柱、Florisil、碱性氧化铝柱、Strata-X-C柱、MCX、MAX对标准溶液和空白样品进行净化效果和回收率考察(以峰面积表示)；发现MAX能较好的保留三聚氰酸，其回收率达到92%左右，且能较好的去除空白样品中的杂质。

4.4 流动相的选择 三聚氰酸呈弱酸性，有较强的极性，在反相色谱柱上的保留时间极短，故在流动相中加入离子对试剂[2]，以延迟三聚氰酸出峰时间，实现更好的分离和较好的峰形。使用离子对试剂三乙胺、四丁基溴化铵对三聚氰酸标准工作液进行色谱分析，四丁基溴化铵的使用效果最佳。

缓冲液pH值、缓冲盐浓度和有机相的浓度均影响三聚氰酸的保留时间。当缓冲液pH值从4.0升至7.4时，三聚氰酸保留时间从12.327min提前至6.412min，而其响应值逐步提高；综合考虑色谱柱的耐受能力与检测限的需要，故选择pH7.0；流动相缓冲盐浓度增大可使三聚氰酸保留时间缩短。采用5mmol/L四丁基溴化铵与5mmol/L磷酸氢二钠溶液1:1(v:v)混匀，5mmol/L的磷酸二氢钠调节pH值为7.0，可实现较好的分离。

三聚氰酸极性大，采用反相HPLC时，有机相的比例对三聚氰酸的峰保留影响相当大；选择一种合适的有机溶剂是必要的。甲醇在低波长有一定吸收，而乙腈在此波长下无吸收，故采用乙腈作为有机相，较好的保证目标物的出峰时间，且基线较好。

随着流动相中乙腈比例的加大，三聚氰酸的保留时间缩短。为避开杂质的干扰，试验比较了15%、12%、9%、8%、5%等五种乙腈浓度流动相的色谱图，结果发现采用5%、8%乙腈浓度，目标峰后面有一干扰峰，当低浓度的时候，干扰很明显；而采用9%乙腈浓度可有效避免干扰峰；采用15%和12%乙腈浓度时保留时间太短，易受干扰峰影响。综合考虑乙腈浓度选择9%。

4.5 检测波长的优化 对三聚氰酸进行190~400nm全波长扫描，光谱图见图1。

图1 三聚氰酸光谱图

三聚氰酸最佳吸收波长为214nm，在214nm波长下，其响应值最高。但在三聚氰酸检测中，214nm波长下，检测基线不平，杂质响应高，干扰物质影响大，试样中三聚氰酸214nm波长条件下色谱图见图2。

而波长在226nm时，干扰小，基线平且能满足试验检测限的需要，试样中三聚氰酸在226nm波长条件下色谱图见图3。

图2 在214nm波长下三聚氰酸的色谱图

图3 在226nm波长下三聚氰酸的色谱图

综合考虑各方面的因素，确定检测最佳波长为226nm。

4.6 方法的检测限 方法的检测限是残留检测中重要的技术指标之一。本方法采用在空白牛奶中添加三聚氰酸，经提取、净化、色谱柱分离和仪器测定，外标法定量，评价整个方法的检测限。按信噪比大于3计算，求得该方法三聚氰酸的检测限为0.5mg/kg；按信噪比大于10计算，定量限为2mg/kg。三聚氰酸标准品色谱图、空白牛奶等色谱图见图4、图5、图6。

图4 三聚氰酸标准品色谱图

图5 空白牛奶色谱图

4.7 方法的线性响应 在相同色谱条件下，将标准工作液依次从低浓度到高浓度进样，每一浓度进样三针，按其所得峰面积的平均值与对应的标准工作液浓度(mg/L)作标准曲线，并计算标准曲线的回归方程及相关系数。实验测得三聚氰酸在浓度0.5~50mg/L范围内色谱峰面积与浓度呈线性相关，其回归方程和相关系数见表1、图7。

图6 空白牛奶添加2三聚氰酸的色谱图

表1 三聚氰酸的标准曲线回归方程和相关系数

图7 HPLC标准曲线(峰面积—标准工作液浓度)色谱图

4.8 三聚氰胺的干扰研究 为探索三聚氰胺是否对本方法中三聚氰酸的检测有干扰，我们分别做了三聚氰胺标准品、三聚氰酸标准品、空白牛奶试样、空白牛奶试样中添加三聚氰酸和三聚氰胺标准品(按本方法操作)、三聚氰胺和三聚氰酸混标的液相色谱分析。结果表明，在226nm波长下，三聚氰胺和三聚氰酸都有吸收，但没有干扰。三聚氰胺的出峰时间为3.3min左右，而三聚氰酸的出峰时间为6min左右，在不同基质中，出峰保留时间稳定，相互之间没有干扰。同时，按本方法检测，三聚氰胺在经过SPE时，没有保留。具体见图8、图9。

图8 三聚氰胺与三聚氰酸混标色谱图

图9 空白牛奶中添加三聚氰酸与三聚氰胺色谱图

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（2012–05–19）

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