12个新引进油棕品种遗传多样性研究

丁 灿 郎南军 林位夫

12个新引进油棕品种遗传多样性研究

丁 灿1，2郎南军3林位夫4，5

(云南农业大学烟草学院1，昆明 650201)
(北京林业大学2，北京 1000834)
(云南省林业科学院3，昆明 650204)
(中国热带农业科学院橡胶研究所4，儋州 571737)
(农业部热带作物栽培生理学重点开放实验室5，儋州 571737)

为研究油棕新品种的遗传多样性，用ISSR分子标记方法对海南的12个油棕新品种进行了遗传多样性分析，结果表明:22个引物用于12个油棕新品种、48个单株材料的扩增，共扩增出185个位点，其多态位点百分率48．6%。不同品种的Gst值为0．5445，即54．45%的变异存在于品种间，45．55%的变异存在于品种内，说明遗传变异主要存在于品种间。据Nei－Li相似系数进行UPGMA分析，12个油棕品种分别聚为4个组:RY1号和RY9号品种各单独为一组，RY2、RY3、RY4、RY5、RY6、RY7、RY8号品种为一组，RY10、RY11、RY12品种为一组。

油棕种质 遗传多样性 ISSR

油棕(Elaeis guineensis Jacq．)属棕榈科油棕属，是多年生木本油料作物，起源于非洲［1］。由于油棕果实含油量高以及单位面积产油量大而被誉称为“世界油王”。

油棕是重要的油料作物和能源作物。棕榈油在我国蕴含着巨大的消费市场:一方面，我国目前人均常年食用油消费量为11．5 kg，不及世界人均消费量15 kg(发达国家为40 kg，美国则为50 kg)［2］，随着我国人口的增长和生活水平的提高，可见我国食用油消费增长空间还很大;另一方面，由于全球性的能源危机日见明显，加之由于大量使用石化能源造成的环境污染日益严重，因而对石油替代品之一的生物柴油将有巨大的需求，而棕榈油是生物柴油生产中最有竞争力的原料，其潜在的市场不言而喻。

我国对棕油的需求量日益增长，目前国内棕油全部依赖于进口，因此发展油棕生产有重要的意义。为了发展油棕生产，我国曾两次较大规模引种，后来主要因为品种的适应性不强及经营管理不当等多方面的原因而失败。适应性不强具体表现为花序败育、结果甚少、产量很低，但也有部分个体植株表现较好。例如在南滨农场适应性较强的日里油棕单株年平均产果穗超过0．0965 t(193斤)。这些适应性强的单株都比它的群体平均值高产75%～134%［3］。我国植棕区地处热带北缘，因此，选育适合我国植棕环境的油棕种质材料是发展我国油棕生产的关键。

与其他大多数的作物相比，现有的油棕品种的遗传基础很狭窄［4－6］。为了拓宽油棕育种的遗传基础，现在世界许多种植油棕的国家如马来西亚、肯尼亚、巴西、哥斯达黎加、尼日利亚等［7－12］都在进行油棕种质资源的收集、鉴定、评价和品种改良等方面的研究，并选育出许多适宜当地生长的优良品种。

中国热带农业科学研究院(简称热农科院)从国外新引进了一批油棕新品种，经过几年的试种结果表明一些品种或单株表现良好，为我国发展油棕生产带来了希望。本研究旨在对这些种质材料(品种)从分子水平上进行遗传多样性的分析研究，可为我国油棕种质资源的科学收集、有效保护、鉴定评价和区划种植提供重要理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料

海南省2000年新选育油棕不同种质材料的取样(共12个品种，代号分别为RY1～RY12):(1)每个品种随机选取15～20个个体，用于代表该品种:每个个体均采集健康、幼嫩叶片保湿并迅速带回实验室清洗凉干，分别将叶片剪碎后等量均匀的混合起来提取的总DNA代表该品种。在每个品种内随机选取4个单株，用于代表单株:每个单株均采集健康、幼嫩的叶片分单株做好标记，提取各单株的DNA(共48个单株)。具体情况见表1。

表1 热农科院(CATAS)12个品种新油棕种质的48个单株序号

1．2 DNA提取、引物筛选、PCR扩增和产物检测

采用改良的CTAB法提取油棕叶片总DNA［13］。

利用加拿大哥伦比亚大学(University of British Columbia，UBC)所设计的60个引物在部分模板中进行筛选，筛选引物遵守如下原则:①产生的DNA带清晰可辨;②在分析的样品之间有较高的多态性;③产生多态性DNA带谱具有重复性。本试验从供试的引物中，筛选出能扩增出多态性的引物23个用于样品的进一步分析。

先通过一定的摸索试验，最终确定用于油棕的各个组分的ISSR最佳反应体系。本试验所采用的优化反应体系总体积为15μL，各个组分的具体用量如下:MgCl2(25 mmol/L)+Buffer(10 X)2．25μL、dNTP(10 mmol/L)0．3μL、Taq酶(5 U/μL)0．15 μL、引物(0．4μmol/μL)1．0μL、模板DNA(50 ng/μL)1．0μL、ddH2O(超纯水)10．3μL。

PCR扩增程序为:94℃预变性4 min，94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min(从第2步到第4步，35个循环)，72℃保温10 min，4℃保温。

特征点识别出后需计算特征值，接着对这些特征值与袖带充气式电子血压计测量的SBP和DBP分别进行相关性分析，并选择相关性比较大的特征值作为回归变量。再接着将这些回归变量分别与SBP和DBP进行线性回归分析，建立血压与这些特征值之间的回归方程。

采用2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色检测扩增产物。在PCR产物中加入2μL溴酚蓝染色后，取10μL PCR扩增产物，用DL2000 DNA mark作对照，在1×TAE缓冲液中电泳，恒压电泳为4 V/cm，1．5～2 h后，在UVIpro凝胶成像系统上观察结果并照相。

1．3 ISSR数据的统计分析方法

每个样品的扩增产物电泳分离谱带在某一位点上按有或无记录，存在时赋值为“1”，无带的记为“0”。将每个引物对所有样品的读带记录结果形成“0－1”矩阵。用NTSYS－pc version 2．1计算Jaccard＇s相似系数，在此基础上用非加权组平均聚类法(unweighted pair－group method with arithmetic average，UPGMA)进行聚类分析，绘制亲缘关系树状图。

2 结果与分析

2．1 12个品种内不同单株间的遗传多样性研究

2．1．1 扩增产物的多态性分析

用22个ISSR引物对12个品种内(每品种4个单株)共48个单株DNA样品进行PCR扩增，扩增结果见表2。

表2 22个ISSR引物及扩增结果

从表2中可以看出，22个引物扩增出的条带数目从4条至14条不等，共扩增出185条带，平均每个引物扩增出条带为8．4条。在所有的引物扩增结果中多态位点百分率最多的是引物UBC812(100%)，最少的是引物UBC856(16．7%)。所有引物共扩增出90个具有多态性的位点，占48．6%。

图1 引物UBC811对48个单株扩增的ISSR图谱

2．1．2 12个品种内不同单株间的聚类分析

根据各单株之间的相似系数，用POPGENE32统计软件对48个单株进行聚类分析，结果如图2所示。

从图2可以看出，所有12个品种48个单株的相似系数都比较高(在0．85～0．98之间)，若在相似系数为0．897处划线，12个品种的48个单株材料被聚为11类:品种RY1中的1、4单株为一类;品种RY2～RY8的大部分单株为一类;品种RY9中的34、35单株为一类;品种RY10～RY12中的大部分单株为一类;23、24单株为一类;36、42、38、46、8、33单株各为一类。

图2 12个品种内48个单株间的非加权组平均法聚类图

因为油棕是既有自花授粉，又有异花授粉的常异花授粉植物，用种子进行有性繁殖的各个单株之间存在一定的变异，因此，同一品种的4个单株并未完全聚合在一起，说明同一品种内有的单株之间存在着明显的差异，在进行杂交育种选择亲本时，不应局限在品种之间进行，也可以在品种内的不同单株之间进行选择。

另外，从图2还可以看出，第29、30号单株以及第14、18、19单株的遗传相似系数极高(在0．98以上)，说明第14号单株(属于品种RY4)在品种内的差异大于品种间的差异。同时也表明同一品种内也有遗传相似度极高的单株(如品种RY5的第18、19号单株以及品种YR8的第29、30号单株)。

2．2 12个品种间的遗传多样性研究

2．2．1 扩增产物的多态性分析

用22个引物共检测到185个位点，平均每个引物扩增出8．41个位点，结果见表3。从表3中可以看出，品种RY9具有多态性的位点数最多(36个)，多态性位点百分率为19．46%;品种RY5多态位点数最少(12个)，多态位点百分率仅为6．49%，平均为13．02%。Nei’s基因多样性指数H为0．024 8～0．083 8;Shannon信息多样性指数I为0．036 6～0．118 7。

表3 12个品种油棕22个引物的ISSR多态位点比率及H、I指数

根据Nei指数计算油棕各品种的遗传分化值，结果见表4。由表4中的分析结果表明12个品种油棕总的基因多样性Ht为0．123 1，其中品种内的基因多样性Hs为0．056 1，品种间的基因多样性Ds为0．067 0，品种间的遗传分化系数Gst为0．544 5，表明有54．45%的遗传变异存在于材料(各品种)之间，45．55%的遗传变异存在于材料(各品种)之内，即遗传变异主要存在于品种间。各品种间的基因流Nm为0．418 3，小于1，表明品种间基因交流有限。

表4 12个品种油棕的遗传分化(由Nei指数估算)

2．2．2 12个品种间的遗传一致度、遗传距离分析

通过电泳分析获得了等位基因频率或基因型频率以后，根据这些数据可以用来测量材料间的遗传学关系，从不同材料间所表现的等位基因频率或基因型频率相同的方面来讲，叫“遗传一致度”(genetic identity)(I)或“遗传相似度”(genetic similarity)，从它们所表现出不同的方面来讲，叫“遗传距离”(genetic distance)［14］。两个亲缘关系越近的居群或种类，在所有位点上的所有等位基因频率越相近，遗传相似性系数越接近1，而遗传距离越接近于0;两个亲缘关系越远的种类，在所有位点上的所有等位基因频率差别越大，遗传相似性系数越接近0，而遗传距离越接近无限大［15］。

由遗传一致度(表5，上三角值)，反映出各品种油棕间的关系，遗传一致度最高的是品种RY4和RY5(0．990 7)，最低的是品种RY1和RY10(0．896 3)。从遗传距离(表5，下三角)上看，品种RY4和RY5的遗传距离最小(0．009 3)，品种RY1和RY10的遗传距离最大(0．109 5)。

2．2．3 12个品种间的聚类分析

图3 12个品种油棕的非加权组平均法聚类图

用POPGENE32统计软件对表5的数据进行聚类分析，其结果如图3所示。从各品种间的UPGMA聚类图上可以更清楚的反映出来，品种RY4和RY5的遗传距离最小，首先聚为一类，表明它们有较近的亲缘关系。以坐标尺8处划线，12个油棕品种根据其遗传差异可分为4个类型组:品种RY1和RY9各单独为一组，品种RY2、RY3、RY4、RY5、RY6、RY7、RY8为一组，品种RY10、RY11、RY12品种为一组。此结果与图3的结果基本一致。

3 讨论

研究结果表明，油棕品种内有45．55%的变异存在于品种内部，说明品种内不同单株间的差异大，以后在进行品种推广之前，要先对各品种的单株做遗传多样性分析，可以把同一品种内亲缘关系差异较大的个体鉴定出来，可对其进行其他方面的研究，但不能用这些个体植株来代表该品种。即利用分子标记技术在油棕种质早期的研究中就可对其亲缘关系进行快速鉴定，为以后选择亲本材料提供一定的依据。

另外，热农科院12个品种内48个不同单株间的聚类结果表明，部分品种内的单株遗传距离较远而自成一类，这是否与每个品种所选择的单株数量偏少(4株)或所用引物数量不够多有关，有待于今后进一步研究。

研究结果表明，油棕不仅品种间存在着丰富的遗传变异，而且品种内的遗传分化也十分明显，这无疑拓宽了在油棕育种工作中可利用的油棕遗传基础。原来引进的部分油棕品种存在适应性不强，导致花序败育等现象，这也是当年我国海南、云南等地区大规模发展油棕种植而失败的一个主要原因之一。为进一步拓宽我国油棕种质的遗传多样性，有选择性的从国外引进新油棕种质，同时加强各地、各品种油棕种质的交叉利用，进一步发掘新油棕种质及原有油棕种质中的优良单株，是拓宽油棕遗传基础的途径之一，也是未来培育油棕良种和发展油棕生产的潜力所在。引进的油棕种质，可对其进行长期的农艺性状观测与抗逆性方面的研究，并且对于各类型聚类中单独一个样品自成一类的油棕种质，也可对其进行深入研究和鉴定，以期发现适应性强、农艺性状较好、尤其是产量高的油棕新种质，为育种及生产服务。

表5 12个品种间的遗传一致度(上三角)和遗传距离(下三角)

4 结论

对热农科院12个品种油棕共48个单株进行扩增，22个引物共扩增出185个位点，其中具有多态性的位点有90个，平均每个引物扩增出8．4条带，扩增产物片断大小在250～1 500 bp之间。具有多态性的位点共有90个，平均多态位点百分率为48．6%。对其遗传多样性研究结果表明，品种间的遗传多样性为54．45%，而品种内的遗传多样性为45．55%，说明遗传变异主要存在于品种间。

热农科院12个油棕品种根据其遗传差异可分为4个组:RY1号和RY9号品种各单独为一组，RY2、RY3、RY4、RY5、RY6、RY7、RY8号品种为一组，RY10、RY11、RY12品种为一组。

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Study on Genetic Diversity of 12 Oil Palm Varieties Introduced Newly

Ding Can1，2Lang Nanjun3Lin Weifu4，5
(School of Tobacco Sciences，Yunnan Agricultural University1，Kunming 650201)
(Beijing Forestry University2，Beijing 1000834)
(Yunnan Academy of Forestry3，Kunming 650204)
(Rubber Research Institute4，CATAS，Danzhou 571737)
(Ministry of Agriculture Key Laboratory for Tropical Crops Physiology5，Danzhou 571737)

To study the genetic diversity of new varieties of oil palm，Inter Simple Sequence Repeat(ISSR)technique was used to assess the genetic diversity of 12 new oil palm varieties which came from Hainan．The results showed:A total number of 185 bands were generated using 22 ISSR primers for 48 accessions，among which 48．6%of the total bands was polymorphic．The Gst of oil palm varieties was 0．5445，indicating that most of the diversity(54．45%)was detected among varieties，while fraction(45．55%)within variety in generally．

The results of cluster analysis based on Nei－Li coefficient revealed that these 12 oil palm varieties were divided into four groups．Varieties RY1 and RY9 took its owned group respectively;Varieties RY2，RY3，RY4，RY5，RY6，RY7 and RY8 were assembled in the same group and Varieties RY10，RY11 and RY12 in the other group．

oil palm germplasm，genetic diversity，ISSR

S792．91

A

1003－0174(2012)05－0060－06

948计划(2009－Z17)

2011－05－31

丁灿，男，1968年出生，讲师，博士，作物栽培

林位夫，男，1955年出生，研究员，博士研究生导师，热带作物栽培学与耕作学、生态学