猴腺病毒(SAdV)PCR检测方法的建立及初步应用

张荣建，贺争鸣

(中国食品药品检定研究院，卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 100050)

猴腺病毒(simian adenovirus，SAdV)，是灵长类动物呼吸道和消化道的常见病毒之一，可引起肺炎、咽炎、肠胃炎、结膜炎等，以粪口途径传播为主，主要感染猕猴、非洲绿猴、黑猩猩和狒狒等［1］。SAdV为线性双链DNA病毒，属腺病毒科，哺乳动物腺病毒属。Esona等人发现SAdV在外观无异常的实验猴群中高度流行且感染株系呈广泛的基因多样性［2］，并存在变种传染给人的风险［3，4］，也有报道称在生产用猴肾细胞和脊灰减毒疫苗检定中分离出一些 SAdV 毒株［5］。

目前国内关于SAdV感染流行情况的研究很少，现有检测方法如病毒分离培养等周期长、特异性较差。我们建立的PCR方法能够实现快速批量检测猴群中 SAdV的感染情况，并且灵敏度较高。本方法只需一步PCR就可以将SAdV与鼠腺病毒(MAD)、犬腺病毒(ICH)、禽腺病毒(CELO)区分开来，并且能检出不同亚属的猴腺病毒(SAdV-1、SAdV-3、SAdV-20)。

1 材料和方法

1.1 样品与毒株来源

65份食蟹猴和恒河猴粪便样本采集自国家药物安全评价中心和协尔鑫生物资源研究所。中国医学科学院医学生物学研究所生产的五批口服脊髓灰质炎减毒活疫(批号分别为:990420A，990422A，990423A，990428A，990505A)和北京天坛生物生产的一批脊髓灰质炎减毒活疫苗(批号:20091106)。BSC-1细胞，本实验室保存;阳性对照SAdV-1(VR-195TM)、SAdV-3(VR-1449TM)、SAdV-20(VR-541TM)购自美国 ATCC;鼠腺病毒(MAD)、禽腺病毒(CELO)、犬腺病毒(ICH)均本实验室保存。

1.2 试剂及仪器

胎牛血清购自杭州四季青公司;PCR热启动反应体系、DL1500 DNA marker、基因组DNA提取试剂盒购自大连宝生物工程有限公司;PCR反应用引物均由上海生工合成;DNA胶回收试剂盒购自杭州Axygen公司。粪便基因组DNA快速提取试剂盒购自北京Abigen公司;日立 CP70ME低温超速离心机。质粒小量快速提取试剂盒(Axygen)购自经科宏达公司。

2 实验方法

2.1 靶基因的选择及引物设计

用Vector NTI多序列比对分析已报道的不同亚属 SAdV和 MAD、ICH、CELO基因组序列，选择SAdV保守性高且与 MAD、ICH、CELO序列有差异区域hexon基因和 pol基因部分序列作为靶序列。针对该区域用Primer Premier 5.0设计五组引物并合成。同时，与文献报道的引物进行比较。

五组引物(1，2，4，5，6)及文献引物(3)的序列见表1:

2.2 SAdV病毒基因组DNA提取

SAdV病毒的细胞培养液经反复冻融3次后10 000 r/min离心5 min，收集上清液。

口服糖丸疫苗先用1 mL PBS溶解。培养液上清、疫苗溶剂和液态疫苗按照基因组DNA提取试剂盒的说明书提取 DNA，400 μL样品提取 20 μL DNA，－20℃保存。

2.3 PCR反应

2.3.1 PCR反应体系:反应体系总体积 25 μL，其中引物体积 0.5 μL(1 μM)，Taq DNA 聚合酶 0.2 μL(1 U)，10× PCR uffer 2.5 不 μL，dNTP mixture(2.5 mM each)2 μL，dd H2O 17.3 μL，待检样品DNA模板2 μL。反应条件，95℃预变性5 min;95℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共 35 个循环;72℃再延伸7 min。

2.3.2 PCR反应条件的优化:引物浓度选取0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L 等 5 个梯度，退火温度选取 60℃、59.5℃、58.6℃、57.2℃、55.5℃、54.3℃、53.5℃、53.0℃等8个梯度，Taq酶的量选取0.5 U、1 U、1.5 U、2 U 等 4 个梯度，循环数选择 20、25、30、40等4个梯度。

扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/mL EB)进行电泳鉴定。

表1 SAdV PCR引物序列Tab．1 Sequences of the SAdV primers

表2 PCR条件优化结果Tab．2 Optimization results of the PCR assay

2.4 特异性鉴定

2.4.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定:取禽腺病毒(CELO)、鼠腺病毒(MAD)、犬腺病毒(ICH)及正常BSC-1细胞培养液。用前述SAdV病毒基因组提取方法提取DNA，分别以这四种DNA为模板，以设计的五组引物及文献报道的引物在优化后的条件下分别进行PCR扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.4.2 测序鉴定:利用 DNA胶回收试剂盒回收PCR产物与pGEM-T克隆载体连接，转化DH5α大肠杆菌，通过初步酶切鉴定，选择阳性克隆送上海生工公司测序。

2.4.3 敏感性的测定:将起始浓度为 47.90 μg/mL的 SAdV DNA样本做倍比稀释，分设 10－1～10－9九个浓度梯度，使用上述6对引物进行PCR扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.5 PCR检测方法的初步应用

2.5.1 实验猴群粪便样本的检测:采集单笼饲养的食蟹猴和恒河猴粪便样本65份，粪便样本核酸的提取按照粪便基因组DNA快速提取试剂盒说明书进行。用特异性与敏感性最佳的PCR方法对粪便样本核酸进行检测，扩增产物按上述方法进行琼脂糖凝胶鉴定和测序鉴定。

序列用Bioedit软件编辑，不同株系的HAdV和SAdV hexon基因序列引自 Genbank。利用 MEGA4软件进行系统发生进化分析，基于引物之间的序列用Neighbor-joining法构建系统发生进化树。

2.5.2 动物源性生物制品的检测:取六批口服脊髓灰质炎减毒活疫，分别按前述SAdV病毒基因组提取方法提取DNA。选择特异性与敏感性最佳的PCR方法进行检测，扩增产物经电泳鉴定。

3 结果

3.1 PCR反应及条件优化结果

选取SAdV-1的阳性对照按将各个因素分别进行PCR，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，按电泳条带选取最佳反应条件。各个引物PCR反应优化结果如表2所示。优化条件后各个引物PCR产物电泳结果如图1，图2所示。

图1 引物1、2 PCR反应优化后结果Fig．1 Optimization results of PCR with the primer 1，2．

3.2 PCR方法特异性验证

3.2.1 琼脂糖凝胶电泳初步鉴定:五组引物在以SAdV为模板时均有明显目的条带出现，阴性对照BSC-1细胞均无目的条带。引物1中ICH有微弱扩增，引物 2中 CELO、ICH、MAD均有扩增，见图 3。引物3(文献引物)PCR特异性检验结果显示G亚属、A亚属和 F亚属的 SAdV-1、SAdV-3和 SAdV-20均有明显的目的条带出现，说明此PCR方法检测谱系广，不同亚属的猴腺病毒均能检出，但 ICH和MAD也有微弱条带出现表明此方法特异性不是很好，见图 4。引物 4中只有 SAdV-1、SAdV-3和SAdV-20有明显的目的条带出现，ICH、MAD、CELO均无目的条带，见图5，说明检测谱系广且特异性好。引物5中只有SAdV-1有明显目的条带出现，ICH、MAD、CELO均无目的条带，说明第五组引物有较好的特异性，见图6。

图2 引物3、4、5、6 PCR反应优化后结果Fig．2 Optimization results of PCR with the primer 3，4，5，6．

图3 引物1、2特异性检测Fig．3 Specificity test for the primer 1，2．

与文献引物相比，引物1、4、5均有较好的特异性，结果见图 3，4，6，8。

3.2.2 测序鉴定:将阳性扩增片断进行克隆测序，测序结果用 BLAST与 NCBI中 SAdV-1序列比对，核苷酸符合率达99%(325/328)，证明是要扩增的SAdV-1目的片段，说明该法特异性好。

3.2.3 敏感性鉴定:PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳显示引物3(文献引物)能检测到的SAdV模板最高稀释度为10－4，所能检测到的最小基因组浓度是4.79 ng/mL。而设计的1、2、4、5组引物能检测到的最高稀释度分别为:10－4、10－5、10－6、10－3。引物 4的灵敏性为文献引物的100倍。

图5 引物4特异性验证Fig．5 Specificity test for the primer 4．

六组引物不同的PCR检测方法经特异性和敏感性鉴定可看出，引物4进行的PCR检测方法的特异性、灵敏度最佳，检测谱系广，不同亚属的猴腺病毒均能检出，适合作为检测猴腺病毒的分子生物学方法。

3.2.4 检测方法的初步应用:

3.2.4.1猴粪便样本的 PCR检测:经 PCR检测，其中有15份食蟹猴样本和17份恒河猴样本出现328 bp的目的条带，呈 SAdV阳性。我国实验猴群中SAdV感染流行情况见表3，食蟹猴感染率高于恒河猴为57.7%，广东地区感染率为60%，高于其它三个地区。

图6 引物5特异性验证Fig．6 Specificity test for the primer 5．

3.2.4.2 SAdV阳性样本的测序鉴定:选取23份SAdV阳性样本测序，并将序列与 NCBI收录的SAdV序列进行比对，同源性为91% ～100%。证明了检测方法的准确性，同时也说明建立的PCR方法能够同时检测出不同型别的SAdV。

3.2.4.3 SAdV系统发生进化树构建:如图7所示，系统进化发生分析表明实验猴群中感染的SAdV型别呈广泛的基因多样性，主要分为3个大基因簇，其中最大一簇与HAdV-G亚属腺病毒进化距离很近，属于 HAdV-G亚属如17M．f等;另一簇与其它亚属相比，与HAdV-G亚属进化距离较近，但与上一簇是明显两个分支如11M．f，与 G亚属的SAdV-7序列同源性为91%。最后一簇与新发现的SAdV-49和SAdV-50株系接近如 xie32M．m，这一基因簇还没有命名且与其它亚属进化距离较远，是否代表新的SAdV亚属还需进一步详细研究。

3.4.2.4 猴源性生物制品的检测:

脊髓灰质炎减毒活疫苗分别提取DNA，经PCR检测，均未检出SAdV核酸序列，见图8。

4 分析与讨论

PCR方法由于其安全、简便快速的特点被广泛应用。SAdV基因组全长约34 000 bp，G+C含量为55.2%［5］，hexon基因和 pol基因部分序列进化上高度保守是PCR引物设计的靶序列，也常用于系统发生进化分析［6］。最近，Esona 等［7］人针对 hexon 基因设计了一对简并引物建立了SAdV PCR检测方法并对广州地区猴群进行了筛查，发现SAdV高度流行且感染株系呈广泛的基因多样性。经特异性验证该PCR检测方法特异性较差，不能将SAdV与犬腺病毒(ICH)和鼠腺病毒(MAD)区分开来。

本实验成功筛选出一对特异性好、灵敏度更高的引物，目的条带大小为328 bp，测序结果与NCBI发表的SAdV-1序列同源性为99%。对引物浓度、Taq酶用量、退火温度、循环次数进行优化，确定了最佳PCR反应条件，建立了 SAdV的 PCR检测方法。本方法只需一步PCR就可以将SAdV与MAD、ICH、CELO区分开来，并且能检出不同亚属的猴腺病毒(SAdV-1、SAdV-3、SAdV-20)，所能检测到的最小DNA模板浓度为47.9 pg/mL，比文献引物灵敏度提高100倍。

Roy的研究表明SAdV可能感染猴小肠上皮细胞，造成SAdV慢性感染并由肠道持续向外排毒，粪便中检出率高［8］。用建立的 PCR检测方法调查SAdV的感染流行情况，发现我国实验猴群中SAdV高度流行且呈现出广泛的基因多样性，与Esona等人报道一致。

由于SAdV经常呈慢性持续感染状态［9］，且在外观无异常的恒河猴和食蟹猴种群中高度流行，最早发现的几株猴腺病毒如 SAdV-1、SAdV-3等是从脊灰疫苗生产和检定过程中分离，因此，需要加强对实验猴群和猴源性生物材料以及相关生物制品中SAdV的检测，避免人类感染SAdV的潜在风险。用建立的PCR法对猴源性生物制品进行检测，未检测到SAdV核酸序列，初步说明目前猴源性生物制品污染SAdV的几率较小，生产和检定过程中质量控制很严格。

表3 PCR方法调查猕猴粪便样本中SAdV的感染流行情况Tab．3 The epidemiological study of SAdV infection detected in rhesus monkey feces by PCR

图7 Mega软件比对人腺病毒和猴腺病毒六邻体基因一段序列(286 bp)建立进化树 (HAdV、SAdV序列来自GenBank中，M．m代表恒河猴，M．f代表食蟹猴)Fig．7 Generation of an evolutionary tree by comparing the sequences(286 bp)of a fragment of hexon gene of human and monkey adenoviruses using Mega software．Root in GenBank;M．m represents rhesus;M．f represents Macaca fascicularis．

图8 猴源性生物制品的检测Fig．8 Detection of SAdV in monkey-origin biological products．

我们所建立的检测SAdV核酸的PCR方法具有快速、简便、准确等优点，可实际应用于监测猴群SAdV感染，通过隔离持续向外排毒个体，切断粪口途径，可以有效避免SAdV在猴群中的传播，也适用于猴源性生物制品SAdV污染的检测，对于建立高质量的实验猴群和保证猴源性生物制品安全意义重大。

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