烟草烟雾暴露对哮喘大鼠气道CCR6 mRNA及其蛋白表达的影响

韩小花，杜永成，张新日，李 毅

(1.山西省人民医院呼吸科，太原 030001;2.山西医科大学第一医院呼吸科，太原 030001)

支气管哮喘(bronchial asthma)是一种常见的慢性呼吸系统疾病。吸烟与哮喘关系密切，长期吸烟可增加哮喘发作的严重度和病死率。吸烟可改变哮喘患者气道炎症的特点，导致哮喘患者激素治疗效果更差，肺功能下降更快。免疫-炎症机制是近几年支气管哮喘研究的热点，趋化因子的作用亦受到了广泛关注。CCR6是趋化因子CCL20唯一的受体，Lukacs NW［1］和 Bracke KR［2］等人的研究表明CCR6不仅在哮喘气道粘膜免疫中的作用非常重要，而且对于烟草烟雾暴露导致的肺部炎症具有重要作用。本文通过观察烟草烟雾暴露对哮喘大鼠气道CCR6 mRNA及蛋白表达的影响，进一步探究吸烟哮喘气道炎症发生的免疫学机制，以期为临床治疗哮喘寻找新的靶点。

1 材料和方法

1.1 实验材料和设备

6～8周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠〔山西医科大学实验动物中心提供，合格证号 SXCK(晋)2009-0001〕40只，平均体重(200±20)g。卵白蛋白(OVA)购自美国 Sigma公司，实验用香烟为湖南中烟工业公司生产的芙蓉牌过滤嘴香烟 (烟碱1.0 mg/支，焦油12.0 mg/支)。兔抗大鼠 CCR6多克隆抗体试剂盒及SABC(兔IgG)试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司;DAB显色剂购自武汉博士德生物工程有限公司;MIAS-2000医学图像分析系统为四川川大智胜软件股份有限公司产品。第一链cDNA合成试剂盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit K1622)为加拿大Permentas公司产品;实时荧光定量 PCR仪(Roche LightCycler1.0)为瑞士Roche公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型制备:40只大鼠按照随机数字表法分为4组:对照组、烟雾暴露组、哮喘组和哮喘+烟雾暴露组，每组10只。参照文献制备哮喘模型［3］:于第 1天和第8天以 10%OVA 1 mL、氢氧化铝100 mg腹腔注射致敏，第14天后置于透明密闭容器中给予1%OVA溶液60 mL雾化吸入激发，中等雾量，1次/d，每次30 min，每周5次，以大鼠出现呼吸加快、口唇发绀、站立不稳等表现为激发成功，连续激发8周。对照组:以生理盐水代替 OVA腹腔注射，第14天后给予生理盐水雾化(60 mL)8周。参照许三林等［4］自制实验性大鼠被动吸烟装置，吸烟室大小(100×80×60)cm。烟雾暴露组:前期制备同对照组，生理盐水雾化30 min后给予大鼠被动吸烟1次，每次吸烟10支，大约1 h，每周吸烟5 d，共吸烟8周。哮喘 +烟雾暴露组:前期制备同哮喘组，从吸入1%OVA开始，每日于雾化激发30 min后，给予被动吸烟，共8周，吸烟方法和时间同烟雾暴露组。

1.2.2 标本采集:末次雾化激发24 h内，25%乌拉坦4 mL/kg腹腔注射麻醉动物，行支气管肺泡灌洗，暴露气管进行插管，3 mL PBS液反复冲洗3遍，回收的灌洗液离心(1 500 r/min)留取重悬细胞沉淀，行白细胞计数，同时涂片用于HE染色进行细胞分类计数。留取右肺组织，放入DEPC处理过的冻存管中－80℃冰箱中冻存，用于 RT-PCR法检测。左肺以中性甲醛固定24 h，常规石蜡包埋、切片，用于免疫组织化学染色、苏木精-伊红(HE)染色。

1.2.3 BALF细胞计数及分类:大鼠支气管肺泡灌洗液行白细胞计数、HE染色及细胞分类计数。

1.2.4 Rear-time PCR检测大鼠肺组织CCR6 mRNA的表达水平:引物由上海生工生物科技有限公司合成。CCR6引物序列:(上游引物)5'-AACATGGTCCTCCTCGTGAC-3'，(下 游 引 物)5'-TACAACACGGGGTTGAGACA-3'，扩增片段大小:137 bp;设β-actin做内参照物。取－80℃保存的肺组织，提取总 RNA，再合成第一链 cDNA，置 －20℃冰箱备用。采用SYBR green荧光染料法反应45个循环，整个过程收集荧光，使各组内每样本与内参扩增效率相同，采用 2－ΔΔCt法［5］计算样本的原始拷贝数，分别扩增 CCR6 mRNA和 β-actin。利用相应软件获得各组样本与内参β-actin相对应的扩增曲线，读取样本 Ct(cycle threshold)值(即在 PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数)，计算ΔCt值(各样本测定基因与内参基因 Ct值的差值)和 ΔΔCt值(其余样品的ΔCt值和对照样本相应基因的 ΔCt值之差)，最终得出2－ΔΔCt值(相对于参考因子基因表达的倍数)以获得四组间CCR6mRNA的相对定量比较，即以正常对照组为参照，其余各组CCR6mRNA相对表达量用参照组的 2－ΔΔCt倍表示。

1.2.5 免疫组织化学染色检测大鼠气道CCR6蛋白的表达:石蜡切片厚4 μm，采用过氧化物酶标记的链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SABC)测定。按照 SABC试剂盒说明书进行操作，CCR6一抗稀释浓度为1:100，阳性表达为支气管上皮细胞胞膜和胞浆内有棕黄色颗粒。切片结果均采用MIAS-2000医学图像分析系统检测，检测每支细支气管上皮细胞的平均光密度(A值)，取5支完整细支气管的平均值代表该切片CCR6蛋白表达的相对含量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠肺组织病理学改变

肺组织HE染色:对照组肺泡及细支气管形态、结构正常，支气管纤毛排列整齐，管腔规则，仅见少量炎性细胞浸润，基底膜较薄;烟雾暴露组支气管纤毛柱状上皮细胞脱落或变性，气道壁增厚，气道壁和肺组织可见巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等炎性细胞浸润;哮喘组气道壁和肺组织可见淋巴细胞、嗜酸粒细胞等炎性细胞浸润，黏膜皱褶增多，部分支气管上皮坏死、脱落，气道壁增厚，管腔狭窄;哮喘+烟雾暴露组肺泡腔不规则扩大，肺泡间隔变薄或断裂，气道壁明显增厚，大量淋巴细胞、嗜酸粒细胞及中性粒细胞浸润(图1～4见彩插3)。

2.2 BALF细胞计数及分类

哮喘组、哮喘 +烟雾暴露组 BALF中白细胞总数、嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞较对照组、烟雾暴露组增加，差异有统计学意义(均 P ＜0.05);哮喘+烟雾暴露组BALF中白细胞总数和中性粒细胞较哮喘组增加，嗜酸粒细胞较哮喘组减少，差异有统计学意义(均P ＜0.05)，见表1。

2.3 各组大鼠肺组织CCR6基因表达的检测结果

利用相应软件分别获得各组样本与内参 βactin相对应的扩增曲线(图5～6见彩插3)以对照组为定标，分别计算得对照组、烟雾暴露组、哮喘组和哮喘+烟雾暴露组的Ct值、△Ct值和△△Ct值，最后算出 2－ΔΔCt值(表 1)。统计学分析哮喘组、哮喘+烟雾暴露组的CCR6mRNA水平均高于对照组、烟雾暴露组，差异有统计学意义(P均 ＜0.01);哮喘+烟雾暴露组的转录水平高于哮喘组，差异有统计学意义(P＜0.01)。

表1各组大鼠BALF中白细胞总数及分类计数(ˉ±s，n=10)Tab．1 Count and classification of white blood cells in the rat BALF

表1各组大鼠BALF中白细胞总数及分类计数(ˉ±s，n=10)Tab．1 Count and classification of white blood cells in the rat BALF

注:与对照组比较，aP ＜0.01，bP ＜0.01;与哮喘组比较，cP ＜0.01．Note:aP ＜0.01，bP ＜0.01，compared with the control group;cP ＜0.01，compared with the OVA exposure group．

组别Groups 白细胞总数WBC(×107/L)嗜酸粒细胞EOS(%)中性粒细胞NEU(%)淋巴细胞LYM(%)巨噬细胞AM(%)对照组Control group 10.1±3.8 1.3±0.7 2.2±1.1 6.3±1 value ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01.8 89.6±2.7烟雾暴露组 Smoke exposure group 47.7±6.8a 0.5±0.3 2.7±1.4 6.6±2.0 90.5±5.4哮喘组OVA exposure group 69.0±3.5b 4.1±1.0a 8.9±2.0a 21.4±3.7a 65.6±3.8a哮喘+暴露组OVA combined smoke 86.7±5.2bc 2.2±1.0ac 19.0±2.8ac 23.8±3.8a 55.2±2.9ac F value 349.1 29.7 129.1 78.4 166.8 P

2.4 各组大鼠气道CCR6蛋白的表达结果

CCR6主要表达于支气管上皮细胞的胞膜和胞浆中，阳性反应产物呈棕黄色。正常对照组，CCR6不表达或仅有弱阳性表达;哮喘组和哮喘+烟雾暴露组的CCR6蛋白表达均明显高于对照组、烟雾暴露组，差异有统计学意义(P均 ＜0.01);哮喘 +烟雾暴露组高于哮喘组，差异有统计学意义(P＜0.01)(图7～10见彩插4)。各组大鼠气道 CCR6蛋白表达结果的比较见表2。

表2 各组大鼠气道CCR6 mRNA及蛋白(A值)水平的比较(±s，n=10)Tab．2 Comparison of CCR6 mRNA and protein levels in the rat airways

表2 各组大鼠气道CCR6 mRNA及蛋白(A值)水平的比较(±s，n=10)Tab．2 Comparison of CCR6 mRNA and protein levels in the rat airways

注:与对照组比较，aP ＜0.01，bP ＜0.001;与哮喘组比较，cP ＜0.01．Note:aP ＜0.01，bP ＜0.001，compared with the control group;cP ＜0.01，compared with the OVA exposure group．

CCR6 A value对照组组别Groups CCR6 mRNA(2 －ΔΔCtvalue)value ＜0.01 ＜0.01 Control group 1.01±0.52 0.299±0.027烟雾暴露组Smoke exposure group 5.55±0.54a 0.442±0.018a哮喘组 OVA exposure group 8.15±0.88b 0.452±0.013b哮喘+暴露组OVA+smoke 15.16±0.87bc 0.531±0.024bc F value 538.15 163.63 P

3 讨论

研究表明烟草烟雾能增加OVA致敏豚鼠气道急性变应性炎症反应［6］，吸烟哮喘气道炎症的特点是Th2细胞反应加强［7］、气道壁以中性粒细胞浸润为主［8］，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)а等炎性细胞因子水平增加［9］，但其机制尚不完全清楚。本实验，烟雾暴露组采用小量吸烟，BALF中性粒细胞数较对照组明显增加，但所占细胞比例无明显变化，表明小量吸烟对BALF细胞分类影响不大。但哮喘大鼠烟雾暴露后BALF白细胞总数及中性粒细胞比例明显增加，嗜酸粒细胞减少，气道周围炎性细胞浸润更加明显，进一步证实烟雾暴露可以加重和改变哮喘气道原有的炎症反应。

趋化因子(chemokine)是一类结构相似、分子量8～10 kD、具有趋化功能的细胞因子的总称。趋化因子通过趋化多种炎症细胞如淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞等，在多种疾病的免疫反应及炎症损伤中发挥着重要作用。近年来，趋化因子在哮喘气道炎症中的作用受到了广泛关注。

趋化因子CCL20是β趋化因子家族的新成员，又称巨噬细胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)，CCR6是CCL20唯一的受体。Lukacs NW 等［1］用 CCR6基因敲除哮喘模型小鼠(CCR6－/－)与野生型小鼠对比研究发现，CCR6－/－小鼠支气管嗜酸粒细胞聚集数量较野生型小鼠降低了10倍，IL-5水平降低了5～8倍，气道阻力降低了2～3倍，同时血浆中IgE水平亦显著降低。同样，由 Leborgne等［10］作者也发现:由CD8+T淋巴细胞启动招募树突状细胞到上皮组织依赖于CCR6/MIP-3α途径。以上研究表明，气道上皮CCR6表达水平在哮喘的气道慢性炎症中起着非常重要的作用。而Bracke KR等［2］研究中发现，烟雾暴露的CCR6－/－小鼠肺组织MIP-3α mRNA及其蛋白表达水平较对照组显著降低;肺泡灌洗液中树突状细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞数量较对照组显著减少;TNF-a基因表达水平较对照组也显著降低。该研究表明，CCR6表达水平对于烟草烟雾暴露导致的肺部炎症也具有重要作用。

研究发现过敏性炎症时气道上皮细胞可分泌大量 CCL20［11］，而 CCR6是 CCL20 唯一的受体，本实验研究了烟雾暴露对哮喘大鼠气道上皮CCR6表达的影响，结果发现，哮喘+烟雾暴露组大鼠气道上皮CCR6 mRNA及其蛋白表达水平较对照组、烟雾暴露组和哮喘组均显著增高，BALF及气道周围炎症细胞明显增加，表明烟草烟雾暴露可通过增加哮喘大鼠气道粘膜CCR6表达水平，促进气道慢性炎症反应。研究表明CCL20表达水平能够被TNF-a等许多前炎性细胞因子和空气微粒上调［12］，吸烟能够使 TNF-a 等炎性细胞因子水平增加［2，9］，结合本实验结果，我们推测烟草烟雾暴露可直接或通过TNF-a等炎症因子的释放间接作用于气道上皮细胞，使其产生大量CCL20，后者与其受体CCR6相互作用，选择性地招募树突状细胞、T淋巴细胞及中性粒细胞并使其活化，从而产生大量炎症介质、细胞因子、氧自由基和蛋白酶等，进一步加重了哮喘大鼠气道炎症反应。

总之，哮喘气道慢性炎症是多种因素综合作用的结果，发生机理非常复杂，烟草烟雾暴露可以加重和改变哮喘气道原有的炎症反应，CCR6在其发生发展过程中有一定作用，但其具体机制尚未完全明了，有待进一步研究。

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