氯苯胍在鸡组织中的残留消除规律研究

班付国，吴宁鹏，李慧素，彭 丽，周红霞

(河南省兽药监察所，郑州 450008)

氯苯胍(Robenidine)是一种新型高效合成抗球虫药，自1977年在我国研制成功后，因其疗效显著、毒性小，并具有提高增重和饲料利用率的作用，在兽医上得到广泛应用。氯苯胍分子式为C15H13C12N5，相对分子质量为334，化学名为1，3－双－对氯苯叉氨基胍，结构式如图1。目前，国内外对于氯苯胍在鸡组织中的残留消除趋势的研究较少［1］。本文以鸡为受试对象，对氯苯胍在鸡组织中的残留消除规律作了研究。

图1 氯苯胍化学结构式

1 材料与方法

1.1 试验动物 健康白来杭鸡，SPF级，体重约2 kg，购于河南农业大学。饲养温度10～20℃，每日换水换食，饲养7 d适应环境。

1.2 仪器 超高效液相色谱 －串联质谱仪(Waters公司);SIGMA 3－30K离心机(德国SIGMA公司);Buchi均质器。

1.3 药品与试剂 氯苯胍标准品，含量93.0%，购于德国Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司;D8－氯苯胍标准品，含量99.3%，购于德国Sigma－Aldrich公司。甲醇、乙腈为色谱纯。

1.4 给药与采样 选试验用白来杭鸡30只，5只为空白，其他饲喂含氯苯胍500 mg/kg饲料7 d，停药后的第0、1、3、5、7天随机各宰杀5只，取肌肉、肝脏、肾脏、皮和脂肪五种组织分别处理。

1.5 测定方法

1.5.1 标准溶液的配制 精密称取氯苯胍标准品10 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成1 mg/mL的标准贮备液。于－18℃保存。

1.5.2 内标溶液的配制(1 mg/mL) 精密称取D8－氯苯胍标准品10 mg，于10 mL容量瓶中，用二甲亚砜溶解后，用甲醇稀释至刻度，制成1 mg/mL的内标储备液。于－18℃保存。

1.5.3 标准曲线 量取标准溶液适量，用85%乙腈稀释，制得浓度为10、20、50、100、200 和500 ng/mL的系列标准溶液(内标溶液均为100 ng/mL)，由低浓度到高浓度，供液相色谱－串联质谱仪测定。以标准溶液中被测组分峰与内标物峰面积的比值为纵坐标，标准溶液中被测组分浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.5.4 色谱及质谱条件

1.5.4.1 色谱条件 色谱柱:Acquity UPLC®BEH C18(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm);柱温:30℃;流动相:A相为乙腈，B相为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.5.4.2 质谱条件 电喷雾离子源;正离子扫描;多反应监测;源温度120℃;脱溶剂温度350℃;电离电压3.0 kV;测试药物定性、定量离子对及对应的碰撞能量见表2。

表2 氯苯胍及D8-氯苯胍定性、定量离子对及锥孔电压、碰撞能量

1.5.5 样品前处理 称取均质后(2±0.02)g试料，置于50 mL离心管内，添加100 μL 100 ng/mL内标溶液，加0.1%甲酸乙腈5 mL，涡旋混合，中速振荡10 min，7500 r/min离心10 min，取上清液于另一10 mL离心管内，加水1 mL，混匀。中性氧化铝小柱用乙腈2 mL活化，取全部提取液过柱，收集全部流出液于10 mL玻璃试管中，再用85%乙腈2 mL淋洗，合并流出液，于40℃下氮气吹至体积小于2 mL，再加入水8 mL，备用。HLB固相萃取柱依次用甲醇3 mL、水3 mL活化，取全部备用液过柱并用水3 mL淋洗，抽干30 s，正己烷3 mL淋洗，抽干10 min，甲醇5 mL洗脱，收集洗脱液，于40℃下氮气吹干，残渣用85%乙腈1.0 mL溶解，涡旋，过滤，供液相色谱－串联质谱仪测定。

1.5.6 回收率的测定 在鸡肌肉、鸡肝脏、鸡肾脏组织中添加50、100、200 μg/kg 三个不同浓度，在鸡脂肪、鸡皮中添加 100、200、400 μg/kg三个不同浓度，各浓度进行5个样品平行试验，重复3次，计算回收率。

2 结果

2.1 氯苯胍、D8－氯苯胍的定量及定性确认 氯苯胍、D8－氯苯胍标准溶液、空白试样溶液及空白添加试样溶液特征离子质量色谱图分别见图2－图4。从图中可以看出，氯苯胍在此条件下图谱无干扰。

2.2 线性、检出限、定量限及回收率 以标准溶液中氯苯胍峰与D8－氯苯胍内标峰面积的比值为纵坐标，氯苯胍浓度为横坐标，作线性回归方程为:Y=8.9885X+146.89，相关系数为 0.9985。氯苯胍在10～500 ng/mL的浓度范围内呈现良好的线性关系。五种组织中氯苯胍的检测限均为5 μg/kg，定量限为10 μg/kg。在氯苯胍三个不同添加浓度进行的回收率试验中，氯苯胍在肝脏、肌肉、肾脏、脂肪和皮中平均回收率分别为82.8% ～103.9%，85.0% ～ 107.6%、76.7% ～ 88.3%、80.9% ～91.6%和80.9% ～108.2%(表3)。

表3 空白鸡组织中氯苯胍添加回收率试验(n=5)

2.3 氯苯胍在五种组织中的残留情况 鸡肌肉、鸡肝脏、鸡肾脏、鸡脂肪和鸡皮中氯苯胍残留随时间的残留变化情况见表4。从表中可以看出，氯苯胍在鸡脂肪中残留量最高，停药第0 d的残留量高达814.4 μg/kg，而在肌肉中的残留量最低，仅为39.4 μg/kg。另外，氯苯胍在肌肉中消除速度很快，在停药后第3天未检出氯苯胍的残留。

表4 鸡组织中氯苯胍的残留浓度 μg/kg

3 讨论

氯苯胍检测方法建立的关键在于样品的净化。文献［2］中报道的净化柱有硅胶柱、阳离子交换柱、C18柱等，通过试验发现，采用HLB固相萃取柱进行净化，可以获得较好的净化效果和较低的批内、批间标准偏差;同时，脂肪和皮肤需要使用中性氧化铝固相萃取柱［3－4］和HLB柱用正己烷淋洗相结合的方法，才能达到较好的净化效果。在此基础上，采用液质联用的方法对五种组织进行了定量分析。

通过饲喂试验发现，鸡肌肉组织在停药后第3天，未检出氯苯胍残留，在停药后第5天，各种组织的残留量均低于农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》的规定［5］。从各组织氯苯胍的残留量上来看，在脂肪中的残留量最高，其次为肝脏，肌肉中的残留量最低。在停药后第7天，除肌肉组织外，其他组织均有检出，表明氯苯胍在鸡体内残留消除较为缓慢。本试验的研究结果对保障消费者身体健康，扩大我国动物食品出口具有重要意义，并对药物代谢动力学研究具有参考价值，为以后的合理用药及制定合理的休药期提供参考。

［1］ Mortier L，Huet A C，Daeseleire E，et al.Deposition and depletion of five anticoccidials in eggs［J］.Agricultural and Food Chemistry，2005，(53):7142 －7149.

［2］ 刘勇军，吴银良，姜艳彬.高效液相色谱法测定鸡组织与鸡蛋中氯苯胍的残留量［J］.色谱，2010，28(9):905 －907.

［3］ Kot－ Wasik A，Wasik A.Determination of robenidine in animal feeds by liquid chromatography coupled with diode－array detection and mass spectrometry after accelerated solvent extraction［J］.Analytica Chimica Acta，2005，543:46 －51.

［4］ Malgorzata Olejnik，Teresa Szprengier－ Juszkiewicz，Piotr Jedziniak.Multi－residue confirmatory method for the determination of twelve coccidiostats in chicken liver using liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］.Chromatography A，2009，1216:8141－8148.

［5］ 农业部235号公告.动物性食品中兽药最高残留限量［Z］.2002.