EGFR抑制剂细胞磷酸化筛选模型的建立与应用

纪潇朗，于冰，金华，周祥，徐春秀，石玉，李祎亮

表皮生长因子受体（EGFR）是一种具有酪氨酸激酶（PTK）活性的跨膜糖蛋白受体，由 N 端胞外区、跨膜区、胞内区 3 部分组成，胞内区共 542 个氨基酸残基，由近膜区、酪氨酸激酶区、C 末端等 3 个亚区构成，近膜区的前13 个氨基酸（645～657）介导胞内二聚化[1]。自身磷酸化位点位于 C 末端，其中 Tyr1068 为最主要的 3 个磷酸化位点（Tyr1068、Tyr1148 和 Tyr1173）之一，与细胞信号传递密切相关[2]。表皮生长因子（EGF）与 EGFR 胞外区 N 端结合，受体之间二聚化形成同源或异源二聚体，二聚体促使EGFR 胞内区氨基酸残基自磷酸化，进而启动胞内信号通路，调控癌细胞的增殖、存活及凋亡[3]。

EGFR 的信号转导通路在肿瘤的形成和发展过程中占据重要地位，已成为肿瘤药物治疗的一个理想靶标。目前，利用 EGF 诱导 A431 肿瘤细胞，定量检测肿瘤细胞膜上EGFR 的 Tyr1068 位点磷酸化水平的 cell-based ELISA 筛选方法文献报道较少，基于作用机制的分析，本文选用EGFR 高表达的 A431 细胞系，EGFR（Tyr1068）自身磷酸化为主要的特异检测指标，确立了 EGF 诱导 A431 细胞磷酸化的筛选条件，并用此方法系统评价了已上市的酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼（gefitinib）、拉帕替尼（lapatinib）以及自研的新活性化合物对 EGFR（Tyr1068）磷酸化的抑制活性，实验结果具有较好的重现性和准确性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 EGF 细胞因子购自以色列 ProSpec公司；37% 甲醛、双氧水购自美国 Sigma 公司；ELISA cell based Kit 购自美国 R & D 公司；无菌去离子水购自美国Amresco 公司；胎牛血清购自美国 Hyclone 公司；DMEM高糖培养基购自美国 Gibco 公司。

1.1.2 主要仪器 Costar 黑色透明底 96 孔板购自美国Corning 公司；SMP500-15418-QWGI 型酶标仪购自美国Molecular Devices 公司。

1.1.3 细胞株 A431 细胞购于北京协和医学院细胞中心。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养、诱导及固定 细胞使用含有 10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 链霉素的 DMEM 高糖培养基，在饱和湿度、37 ℃ 和 5% CO2条件下常规培养。当细胞生长至约 80%～90% 汇合时，将细胞进行 1∶2 传代，约 2～3 d 传代 1 次。取生长良好对数生长期细胞经胰蛋白酶消化后以优化细胞数接种于黑色透明底 96 孔板，在饱和湿度、37 ℃、5% CO2培养箱中培养 24 h。加入预先配置好所检测的酪氨酸激酶抑制剂，放入 37 ℃ 细胞培养箱中孵育适当时间，加入适量 EGF 等细胞因子刺激诱导。经诱导后立即吸出孔内液体，每孔加入 100 μl 预先配好的 4% 甲醛溶液固定细胞，室温放置 20 min。实验均重复 5 次，并平行设置 5 个复孔。

1.2.2 细胞板封闭及抗体结合 吸出甲醛溶液，加入洗涤液洗涤，每孔 200 μl 洗液，洗涤 3 次，每次 5 min，每孔加入 100 µl 浓度为 0.6% 的 H2O2终止液，室温放置20 min，吸取终止液，洗涤；每孔加入含 35% 胎牛血清的封闭液 100 µl，室温放置 1 h，吸取封闭液，洗涤；每孔加入 100 µl 连接抗体混合液（羊抗总 EGFR 抗体连接膜内总蛋白，鼠抗 Phospho-EGFR 抗体连接膜内磷酸化蛋白），2～8 ℃ 孵育 16 h，吸取连接抗体混合液，洗涤；每孔加入100 µl 标记抗体混合液（连接辣根过氧化物酶及碱性磷酸酶的标记抗体，以碱性磷酸酶标记的羊抗 IgG 识别羊抗总EGFR 抗体、以辣根过氧化物酶标记的鼠抗 IgG 识别鼠抗Phospho-EGFR 抗体），室温放置 2 h。

1.2.3 荧光检测 吸取标记抗体混合液，经洗液及 PBS分别洗涤后，每孔加入 150 µl 显色剂，室温避光放置 20 ～60 min。酶标仪检测 RFUs 值，以 540 nm/360 nm 激发光激发，600 nm/450 nm 检测。600 nm 检测值为 P-EGFR（Tyr1068）蛋白含量值，450 nm 检测值为细胞总蛋白含量值。以公式：P-EGFR =（F1-B1）/（F2-B2）计算细胞内磷酸化蛋白的比率，确定细胞上总蛋白、磷酸化蛋白的含量。其中 F1 和 F2 分别为 600 nm 和 450 nm 处所测的样品荧光强度值； B1 和 B2 分别为 600 nm 和 450 nm 处空白对照的荧光强度值。

1.2.4 EGF 细胞因子用量及诱导时间优化 EGF 诱导刺激时间分别为 5、10、20 min，EGF 用量（包括阴性对照）设置 8 个浓度，分别为 0、5、10、20、40、80、160、320 ng/ml。根据参考文献[4-5]及工作经验，反应体系中A431 细胞密度设定为 10000 个/孔。

1.2.5 A431 细胞接种密度优化 细胞用量设置 7 个浓度，分别为 80000、40000、20000、10000、5000、2500、1250 个/孔。设置添加 EGF 细胞因子与不添加 EGF 细胞因子诱导刺激细胞作对比检测。根据已确定的 EGF 实验条件，以反应体系中磷酸化蛋白水平确定 A431 细胞的最佳用量。

1.2.6 小分子酪氨酸激酶抑制剂透膜给药时间的确定 设置 5 个孵育时间点，分别为 6、3、1.5、0.75、0.375 h。选用吉非替尼为阳性测试药，添加浓度为 20 nmol/L。据已确定的反应体系条件，反应体系中 EGF 刺激时间为 10 min、用量为 100 ng/ml，A431 细胞为 10000 个/孔。

1.2.7 EGFR（Tyr1068）磷酸化抑制活性测定 取小分子酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼、吉非替尼及本实验室自行研发的具有小分子酪氨酸激酶抑制作用的化合物进行测活。药物设置 7 个浓度，分别为 0.1、1、5、10、100、500、1000 nmol/L。反应体系中 EGF刺激时间为 10 min、用量为 100 ng/ml，A431 细胞为 10000 个/孔，药物孵育时间 1.5 h。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 EGF 细胞因子最佳用量及诱导时间

当 A431 细胞为 10000 个/孔时，磷酸化水平与 EGF添加量成正比例增长。EGF 诱导时间在本实验中所设置的3 个时间点中影响差异较小。组内 3 种不同时间 EGF 诱导下，A431 细胞磷酸化差别不大，从图 1 中观察到 EGF在 10 min、40～160 ng/ml 浓度间表现出较其他两组略高的斜率，磷酸化水平变化最敏感，考虑到 5 min 诱导时间在组间或不同批次 A431 细胞不同状态下存在的诱导时间不足、磷酸化不充分等情况，因此选用 10 min、100 ng/ml 为EGF 诱导的最优化条件。

图1 A431 细胞经不同浓度、不同时间 EGF 诱导后磷酸化检测值

2.2 A431 细胞最佳接种密度

经 EGF 诱导刺激 A431 细胞，该细胞磷酸化水平随细胞量逐渐增多呈正比增长，增长较明显。未经 EGF诱导刺激的细胞随细胞数量增加磷酸化水平增长趋势不明显，不适宜用于实验。因此，证明 A431 细胞最佳用量为10000 个/孔（图 2）。

图2 不同密度 A431 细胞 EGFR（Y1068）磷酸化检测值

2.3 小分子酪氨酸激酶抑制剂透膜给药时间的确定

由图 3 可知，随给药后孵育时间延长，抑制剂对 EGFR磷酸化水平抑制率略微升高，但药物孵育时间长短对抑制率无明显影响。因此，选用 1.5 h 为最佳药物孵育时间。

图3 吉非替尼不同孵育时间对 A431 细胞 EGFR（Y1068）磷酸化抑制率

2.4 拉帕替尼、吉非替尼对 A431 细胞磷酸化抑制率及活性化合物 IC50 值

拉帕替尼、吉非替尼对 A431 细胞 EGFR（Tyr1068）磷酸化有显著的抑制作用，其磷酸化水平随给药浓度增加而降低。拉帕替尼 IC50为 22.65 nmol/L；吉非替尼 IC50为11.45 nmol/L；部分活性化合物 IC50值见表 1。

表1 部分活性化合物 A431 细胞EGFR（Y1068）磷酸化的 IC50

3 讨论

EGFR 是一种跨膜受体，存在至少 5 种不同的配体，其中 EGF 在细胞生长调节和分化中起重要作用[6]。研究显示，多种实体肿瘤存在 EGFR 的高表达或突变，70% 以上生长的肿瘤细胞存在该受体及其配基，PI3K/Akt 和 Ras/Raf/MAPK 是其重要的下游信号转导通路，与肿瘤细胞增殖、抗凋亡、血管形成、侵袭、转移以及放化疗拮抗等多种恶性生物学行为密切相关[7]。同时，越来越多的研究证实，EGFR 家族受体可进入细胞核内，并发挥更为广泛的作用[8]。

吉非替尼及拉帕替尼均是小分子的酪氨酸激酶抑制剂，该类药物进入细胞后作用于 EGFR 的酪氨酸激酶区域，阻断 EGFR 信号通路[9]。本文以吉非替尼、拉帕替尼为阳性对照药，验证筛选条件的可行性，实验表明，该筛选条件的实验操作简便，结果稳定、可靠，并从大量活性化合物中筛选出 4 个具有良好活性的全新化合物。

本文的筛选体系有别于传统的 ELISA 方法：实验选用A431 细胞作为细胞模型，该细胞具有 EGFR 高表达特点，对 EGF 敏感性高，经 EGF 诱导刺激后自磷酸化水平显著提高；以完整未裂解的细胞为检测对象，无需抗体包被细胞板，可避免操作当中因包被不均匀所带来的误差；此外，本方法设立空白和对照，无需做标准曲线作为比对，是一种简便、准确、快速的定量检测体系；本方法可同时检测出细胞EGFR 蛋白总含量及磷酸化蛋白的含量，可以量化 Western blot 法对蛋白的检测结果。

本筛选体系对悬浮型和贴壁型细胞均适用，除选择EGFR 高表达的 A431 细胞以外，也可用于其他细胞EGFR 的 Tyr1068 位点磷酸化水平的检测，可广泛地应用于多种酪氨酸抑制剂特异性的细胞水平的筛选，为酪氨酸激酶抑制剂的高通量筛选提供一种高效、简便、准确的方法选择。

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