阿可拉定对子宫内膜癌 HEC-1B 细胞雌激素受体表达的影响

彭瑶，张文谨，连增林，靳冉，李晋生，孟坤

子宫内膜癌是常见的恶性肿瘤之一，严重威胁女性健康。目前治疗子宫内膜癌的方法主要有手术治疗、放射治疗、化学抗癌药物及激素治疗等[1]。中药类抗癌药物具有有效、低毒的优势，作为治疗肿瘤的替代或辅助疗法日益受到人们的关注。

阿可拉定（SNG-162）是从中药淫羊藿中分离提取得到的单一有效成分淫羊藿黄素，以近期发现的新型雌激素受体亚型 ER-α36 为作用靶点，临床适应证为乳腺癌、子宫内膜癌以及雌激素受体亚型ER-α36 阳性的相关肿瘤。本实验主要观察阿可拉定及与顺铂联合用药对子宫内膜癌细胞的抗肿瘤作用，研究其对 ER-α36 及ER-α66 表达的影响，探讨其可能的作用机制，为子宫内膜癌患者的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物及试剂 阿可拉定由北京珅奥基医药科技有限公司提供，黄色粉末状，用 DMSO 配制成浓度为4 mmol/L的储存液，4 ℃ 避光保存，使用前用含 10% 胎牛血清的DMEM 培养液稀释到相应浓度，且预实验结果表明：储存液稀释到相应浓度后，细胞培养液中 DMSO 所占比例小于1%，对细胞生长无影响（同无 DMSO 培养液相比较，P ＞0.05）。顺铂（DDP）购自中日友好医院；胎牛血清（FBS）、DMEM（高糖）培养基粉末、噻唑蓝（MTT）、胰蛋白酶（0.25%）为Gibco公司产品；二甲基亚砜（DMSO）为北京化工厂产品；TRIzol 为美国 Invitrogen公司产品；逆转录试剂盒为美国 Promega公司产品；PCR 引物、100 bp DNA ladder、Taq 酶、dNTPs、PCR 缓冲液、PCR 染料均在北京赛百胜基因技术有限公司合成和购置。

1.1.2 细胞株 人子宫内膜癌 HEC-1B 细胞购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.3 仪器 凝胶成像仪购自美国 Bio-Rad公司；EDC-810 基因扩增仪购自北京东胜创新生物科技有限公司；HERA cell 150 恒温 CO2培养箱购自美国 Thermo公司；倒置显微镜购自日本 Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人子宫内膜癌 HEC-1B 细胞用含 10% FBS的DMEM 培养液，在细胞孵育箱中 37 ℃、5% CO2及饱和湿度下培养，每 2～3 天传代 1 次。

1.2.2 MTT 法检测细胞增殖状况 选取对数生长期的HEC-1B 细胞，用 0.25%的胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，以 8×104个/ml的密度接种于96 孔板，每孔 100 μl，每个药物浓度设 5个复孔；24 h 后吸出孔内培养液，加入 100 μl 含不同浓度 SNG-162的培养液，药物浓度为1、5、10、20 μmol/L；另设空白对照孔，分别继续培养 24、48、72 h。每孔加入 10 μl（5 mg/ml）MTT，置于37 ℃ 培养箱中继续培养 4 h 后终止培养，小心吸出孔内培养液，每孔加入 100 μl DMSO，轻微振荡，充分溶解结晶。选择 492、630 nm 波长，酶标仪测定各孔的吸光度值（A），计算平均吸光度值A（A630－A492）及细胞生长抑制率。抑制率=1－A实验组/A对照组。

1.2.3 RT-PCR 检测 ER-α36、ER-α66 基因表达 HEC-1B 细胞接种在10 cm2培养皿中，接种密度为105个/ml，培养条件同上，24 h 后吸出皿内培养液，加含 SNG-162的培养基 2.5 μmol/L、DDP（2.5μg/ml）、SNG-162 联合 DDP（2.5 μmol/L、2.5μg/ml），另设空白对照组，继续培养 48 h。用TRIzol 裂解细胞，按照 TRIzol 使用说明书提取总 RNA，紫外分光光度计测 A260和A280，计算A260/A280≥ 1.8 合格，计算总 RNA 浓度。按照逆转录反应试剂盒说明进行 cDNA 合成。PCR 引物序列为：ER-α36 上游引物：5' TGGTTTCCTCGTG TCTAA 3'，下游引物：5' CAAAGTTTGTGGGT AGCT 3'，产物长度为219 bp；ER-α66 上游引物：5′ TCTACAGGCCAAATTCAGATAATCGA 3′，下游引物：5′ CCCTCACAGGACCAGACTCCATA 3′，产物长度为166 bp；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）上游引物：5' ACGGATTTGGTCGTATT GGG 3'，下游引物：5' TGATTTTGGAGGGATCTC GC 3'，产物长度为220 bp。扩增条件均为95 ℃ 变性 5 min；95 ℃ 变性 40 s，55 ℃ 退火 40 s，72 ℃延伸 50 s，共 39个循环；最后72 ℃ 延伸 10 min。使用 PCR 仪进行扩增，以 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物，以凝胶成像系统拍照后用quantity one 软件进行图像分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 阿可拉定抑制肿瘤细胞增殖

以阿可拉定处理 HEC-1B 细胞 24 h 后，细胞出现形态学的改变，48、72 h 后出现胞质浓集、细胞膜破裂现象。其抑制作用随药物浓度和给药时间的增加逐渐增强（图 1）。根据各组抑制率及药物浓度的对数，采用回归方程计算出72 h 阿可拉定的IC50值为5.26 μmol/L。

图1 不同浓度阿可拉定对 HEC-1B 细胞增殖的影响Figure1 The effect of SNG-162 on HEC-1B cell proliferation

2.2 阿可拉定抑制 ER-α36 基因表达

实验结果表明：与空白对照组比较，SNG-162组、SNG-162 联合 DDP组均可明显降低 ER-α36的表达（P＜0.05）。其中，SNG-162 联合 DDP组对该基因的影响最显著（P＜0.01）；与空白对照组比较，SNG-162 联合 DDP 给药组能够显著抑制细胞中 ER-α66的表达（P＜0.01）。（表1，图 2）

表1 各给药组对 HEC-1B 细胞 ER-α36、ER-α66的表达影响灰度值（ ）Table1 The gray value of ER-α36, ER-α66 in different groups ( )

表1 各给药组对 HEC-1B 细胞 ER-α36、ER-α66的表达影响灰度值（ ）Table1 The gray value of ER-α36, ER-α66 in different groups ( )

注：与对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01。Note: Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01.

组别 Groups 药物浓度 Concentration ER-α36/GAPDH ER-α66/GAPDH对照组 Control group 0 0.63±0.08 0.72±0.00 SNG-162组 SNG-162 group 2.5 μmol/L 0.35±0.02* 0.69±0.06 DDP组 DDP group 2.5μg/ml 0.57±0.05 0.84±0.04 SNG-162 + DDP组 SNG-162 combined with DDP group 2.5 μmol/L + 2.5μg/ml 0.13±0.02** 0.28±0.02**

图2 各给药组对 HEC-1B 细胞 ER-α36、ER-α66 表达的影响Figure2 The PCR images of HEC-1B ER-α36, ER-α66 expression in different groups

3 讨论

子宫内膜癌是妇科常见肿瘤之一，常分为雌激素依赖性和非雌激素依赖性两种类型。其中雌激素依赖性子宫内膜癌的发生与雌激素过度刺激及雌激素受体表达程度有关[2]。

雌激素受体蛋白由 595个氨基酸组成，分子质量为66 kD，被称为ER-α66。近年来，发现 ER-α尚有一个分子质量为35.7 kD的新亚型，被命名为ER-α36。两者不同之处在于ER-α36 缺乏两个转录激活功能区 AF-1和AF-2，却仍然保留着 DNA结合区和部分配基结合区[3]。ER-α66 为核受体，而ER-α36 为膜受体[4]，ER-α36 可激活膜介导的雌激素信号传导途径，在细胞的内外信息交流中发挥重要作用。

ER-α36 在细胞的生长与凋亡中发挥重要作用[5]，该受体参与了子宫内膜癌中睾酮诱导的细胞增殖信号通路的调节[6]；部分雌激素通过细胞内信号传导途径的快速作用来调节细胞核基因转录和蛋白合成[7]；通过膜受体 ER-α36的介导，激活了PKCδ/ERK 通路且增强了 D1/cdk4的表达，表明ER-α36 很可能具有促进子宫内膜癌细胞增殖的效应[8]。

阿可拉定是以 ER-α36 为靶点从中药淫羊藿中分离提取得到的单一有效成分，能够抑制ER-α36的表达及肿瘤细胞的增殖。顺铂为金属铂类络合物，属周期非特异性抗肿瘤药。在细胞内低氯环境中迅速解离，以水合阳离子的形式与细胞内DNA结合形成链间、链内或蛋白质 DNA 交联，从而破坏 DNA的结构和功能，但对 RNA和蛋白质的合成无抑制作用[9]。顺铂抗瘤谱广，但对子宫内膜癌等雌激素受体相关癌症无特异性靶点作用，且毒副作用强烈[10]。

本实验结果表明，阿可拉定能够显著抑制子宫内膜癌细胞的增殖及ER-α36 基因的表达，与顺铂联用能够增强其作用效果。由此推测，阿可拉定抑制子宫内膜癌细胞的增殖可能与抑制细胞中新型雌激素受体 ER-α36的基因表达有关；阿可拉定能够增强顺铂的抗肿瘤作用。

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