热疗增强长春瑞滨对人肺癌PLA - 801D细胞株毒性的实验研究

孙胜杰，吴志勇，焦顺昌（解放军总医院肿瘤内科，北京 100853）

肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，发病率日渐升高。在我国，肺癌占常见恶性肿瘤的首位，死亡率名列城市肿瘤死亡率的首位［1］。针对肺癌的化疗在临床上占有重要的地位，但其远期疗效较差。近年来，热疗作为一种新的治癌方法正引起医学界的重视，尤其是热疗与化疗联合应用，可以提高某些化疗药物的敏感性[2-6]。本研究旨在探讨温热对长春瑞滨增敏的规律及机制，为临床治疗提供实验参考。

1 材料和方法

1.1 药品和试剂

RPMI/1640培养液（GIBCO公司），胎牛血清（北京元亨圣马生物技术研究所），MTT（AMRESCO公司）；二甲基亚砜（DMSO，天津市科密欧化学试剂开发中心），碘化丙啶（PI，Sigma公司）和RNA酶（Sigma公司）；长春瑞滨（NVB，法国Pierre Farmos）。

1.2 主要仪器

WJ-301TVBA二氧化碳孵箱（美国Baxter），96孔板（美国COSTOR-3599），Multiskan MK3 353酶标仪（上海雷勃分析仪器有限公司），YKH-Ⅱ型液体快速混合器（江西医疗器械厂），XPTH-42电热恒温循环水槽（北京煤炭利用研究所，温度波动在±0.1 ℃）。

1.3 细胞培养与计数

人肺巨细胞癌细胞株（PLA - 801D）由解放军总医院病理科提供，细胞用RPMI/1640培养液(含10%胎牛血清，100 u·mL-1青霉素，100 u·mL-1链霉素)，置于37 ℃，5%CO2培养箱中常规传代培养。细胞制成悬液，加20 g·L-1台盼蓝染液混匀，细胞计数板计数活细胞数。全部实验用细胞均处于对数生长期。

1.4 MTT法测定肺癌细胞生长抑制率达30%时的NVB浓度（IC30）

取对数生长期的人肺巨细胞癌细胞按0.6×106· mL-1的密度接种于96孔板（200 μL/孔）, 培养24 h使其完全附壁后，加入以1.5倍倍比稀释的18个不同浓度的NVB溶液（初始浓度5 mg · mL-1），纵向顺序重复3孔。在37 ℃、5%CO2及饱和湿度的条件下培养1 h将药液快速吸出并加入新鲜培养液200 μL，培养24 h后加入浓度为2.5 g·L-1的MTT试剂20 μL，4 h后快速翻板倒出含有MTT的培养液，每孔加入150 μL的DMSO，振荡5 min后酶标仪（测定波长492 nm）测定每孔OD值。按下列公式计算各浓度的抑制率：抑制率（%） = 1 – （实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。以抑制率为纵坐标，药物对数浓度为横坐标轴绘制该细胞株的药物剂量-效应曲线图，同时计算出抑制率达30%时的NVB浓度（IC30）。

1.5 MTT法测定NVB与温热以不同时序性联合对肺癌细胞的抑制率

取38、39、40、41、42、43 ℃6个热疗温度，每个温度下分别设立热疗前24 h化疗组、热疗前18 h化疗组、热疗前12 h化疗组、热疗前6 h化疗组、热化疗同时作用组、热疗后6 h化疗组、热疗后12 h化疗组、热疗后18 h化疗组、热疗后24 h化疗组9种不同时序性的热化疗结合方式。具体步骤为：1）取同一培养瓶的PLA-801D细胞以同样的条件接种于两板96孔培养板（浓度0.6×105·mL-1，200 μL/孔)，其中一板为对照板（包括单纯细胞对照和不同时间点的单纯化疗对照），另一板为实验板（包括单纯热疗组和以不同时序性结合的热化疗联合组）；2）两板细胞培养24 h待其完全附壁后，于第0、6、12、18、24、30、36、42、48 h分别在两板细胞的3、4、5、6、7、8、9、10、11列加入抑制率为30%的NVB溶液（每列纵向重复5孔），每次作用1 h后吸净上清液，加入新鲜培养液200 μL。其中，第24小时加药后立即将实验板放入设定温度的电热恒温循环水槽中加热，温热与药物同时作用1 h后弃上清液；3）待吸净第48小时的上清液（即第11列）后将细胞培养12 h，加入MTT，4 h后酶标仪（测定波长492 nm）测定每孔OD值；按下面公式计算各个温度下热疗与NVB以不同时序性结合对肺癌细胞的抑制率：抑制率（%）=1 – （实验组平均OD值/细胞对照组平均OD值）×100%。

1.6 流式细胞仪分析

取42 ℃温热条件下的细胞对照组、单纯热疗组、单纯化疗组、先化后热组（热疗前1.5 h化疗）、热化同时组（热疗与药物同时作用1 h）、先热后化组（热疗后1.5 h化疗），将各组按实验步骤处理后，收集细胞，70%乙醇于–20 ℃固定过夜，洗涤后RNA酶作用30 min，加入碘化丙啶（PI）50 μg·mL-1，4 ℃下避光染色，30 min后流式细胞仪检测,分析各组细胞周期分布。

1.7 统计学分析

采用SPSS11.0统计软件处理数据。以t检验、单因素方差分析比较两组和多组间的（±s）；线性相关与直线回归分析两个变量之间的相互关系；P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法测定肺癌细胞生长抑制率达30%时的NVB浓度（IC30）

不同浓度的NVB对PLA-801D细胞作用1 h后,抑制率与药物浓度呈正相关，通过直线回归分析求出NVB浓度（x）与抑制率（y）的回归方程：y＝0.019 55＋0.004 07x，计算NVB的IC30约为68.91 μg·mL-1。

2.2 MTT法测定NVB与各个温度下的热疗以不同时序性联合对肺癌细胞的抑制率

42 ～ 43 ℃的单纯热疗可直接杀伤肺癌细胞，38 ～ 41 ℃的单纯热疗（抑制率为负值）促进了肺癌细胞的增长（与细胞对照组相比，P值均 ＜ 0.001）；不同温度下的热疗与NVB联合应用时，热化同时作用组对肺癌细胞的抑制率最高，既高于单纯热疗组和单纯化疗各组，也高于先化后热各组和先热后化各组（P值均 ＜ 0.01），而且随着温度的升高，热化同时作用组的抑制率也升高，即温度与抑制率呈正相关（r＝0.921 7，P ＜ 0.01）；42 ～ 43 ℃的热疗与NVB联合应用时，各组的抑制率均高于相对应时间点的单纯化疗组（P值均 ＜ 0.05），而38 ～ 41 ℃的热疗与NVB联合应用时，除热化同时作用组（P值均 ＜ 0.001）外，其余各组（P值均 ＜ 0.05）的抑制率均低于相对应时间点的单纯化疗组（见图1）。

在38 ～ 43 ℃温热条件下，热疗前6 h化疗组和热疗后6 h化疗组之间的抑制率有较大幅度的变化，为了进一步研究此段时间内曲线的变化趋势，我们又将此12 h细分为热疗前4.5 h化疗组、热疗前3 h化疗组、热疗前1.5 h化疗组、热化疗同时作用组、热疗后1.5 h化疗组、热疗后3 h化疗组、热疗后4.5 h化疗组等结合方式，热疗、化疗每次均为1 h，热疗温度取42 ℃，结果见图2。

图1 38 ～ 43 ℃温热与NVB以不同时序性联合对肺癌细胞生长的抑制率曲线（48 h内）A - 热疗前24 h；B - 热疗前18 h；C - 热疗前12 h；D - 热疗前6 h；E - 热疗时间；F - 热疗后6 h；G - 热疗后12 h；H - 热疗后18 h；I - 热疗后24 h；与热化疗联合时间对应的单纯化疗对照组；不同序贯方式结合的热化疗联合组；单纯热疗组Fig 1 The curves of inhibited rates to PLA - 801D of the groups of combined treatment of 38 - 43 ℃ hyperthermia and NVB in different sequences(within 48 h)A - 24 hours before hyperthermia; B - 18 hours before hyperthermia; C - 12 hours before hyperthermia; D - 6 hours before hyperthermia;E-hyperthermia time; F-6 hours after hyperthermia; G-12 hours after hyperthermia; H-18 hours after hyperthermia; I-24 hours after hyperthermia)single chemotherapy group;hyperthermia-chemical combination treatment group;single thermotherapy group

图2 结果显示：热化同时组对肺癌细胞的抑制率仍然最高，而且热疗后3 h内进行化疗对肺癌细胞的抑制率也较高（与其余各组相比，P 值均 ＜ 0.05）。

2.3 NVB与42 ℃温热以不同的时序性联合对细胞周期的影响

NVB属细胞周期特异性药物，它主要使细胞周期阻滞于M期，故单纯化疗时，处于G2/M期的细胞增多；S期细胞对高热最敏感，故单纯42 ℃热疗主要作用于S期，使S期细胞减少；与单纯化疗组相比，热化同时组、先热后化组（热疗后1.5 h化疗）和先化后热组（热疗前1.5 h化疗）的G0/G1、S期细胞所占比例增加，G2/M期细胞减少，其中以抑制率最高的热化同时组变化最大，抑制率较高的先热后化组次之，抑制率较低的先化后热组最小，即各组抑制率与细胞周期的影响程度有关。具体见表1及图3。注：与对照组相比，P＜0.05

图2 42 ℃温热与NVB以不同时序性联合对肺癌细胞生长的抑制率曲线（12 h内）A - 热疗前6 h；B - 热疗前4.5 h；C - 热疗前3 h；D - 热疗前1.5 h；E - 热疗时间；F - 热疗后1.5 h；G - 热疗后3 h；H - 热疗后4.5 h；I - 热疗后6 hFig 2 The curves of inhibited rates to PLA-801D of the groups of combined treatment of 42 ℃ hyperthermia and NVB in different sequences (within 12 h)A - 6 hours before hyperthermia; B - 4.5 hours before hyperthermia;C - 3 hours before hyperthermia; D - 1.5 hours before hyperthermia;E - hyperthermia time; F - 1.5 hours after hyperthermia; G - 3 hours after hyperthermia; H - 4.5 hours after hyperthermia;i- 6 hours after hyperthermia

表1 肺癌细胞经42 ℃温热与NVB处理后各细胞周期的变化.%，n = 6， ±sTab 1 The changes in cell cycle of lung carcinoma cells treated with 42 ℃ hyperthermia and vinorelbine. %, n = 6, ±s

表1 肺癌细胞经42 ℃温热与NVB处理后各细胞周期的变化.%，n = 6， ±sTab 1 The changes in cell cycle of lung carcinoma cells treated with 42 ℃ hyperthermia and vinorelbine. %, n = 6, ±s

注：与对照组相比，P ＜ 0.05Note：compared with control group, P＜0.05

组别 G0/G1期 G2/M期 S期细胞对照组 41.63±1.40 16.31±0.56 42.06±0.89单纯化疗组 5.35±1.13 76.24±2.26 18.41±1.55单纯热疗组 46.36±3.89 22.78±3.84 30.86±0.05先化后热组 7.26±0.72 66.37±3.43 26.37±2.73热化同时组 14.70±1.61 34.66±5.89 50.64±4.28先热后化组 7.61±2.49 58.92±5.54 33.47±3.32

3 讨论

近几年关于热疗对化疗增敏作用机理的研究[7-8]认为：1)热疗提高了瘤细胞膜的通透性，有利于化疗药物的渗透和吸收，从而保持细胞内较高的药物浓度。细胞内药物浓度的大小，直接关系到治疗效果，而细胞通常可以通过药泵将药物泵出细胞外，导致发生耐药。高温可以使细胞膜的生物完整性受到破坏，通透性升高，促进药物通过细胞膜进入细胞。2）高温改变药物在体内的代谢，增加细胞内药物的堆积，增强靶结构的敏感性，提高药物对细胞的杀伤力，抑制抗癌药引起的癌细胞损伤修复，防止和减轻耐药性的发生。3）热疗可以促进化疗药物诱发的细胞凋亡。

图3 42 ℃温热与NVB以不同时序性联合对细胞周期的影响a – 细胞对照组；b – 单纯化疗组；c – 单纯热疗组；d – 先化后热组；e – 热化同时组；f – 先热后化组Fig 3 Effect of 42 ℃ hyperthermia combination with NVB in different sequences on cell cyclea – cell control; b – simple chemotherapy; c – simple hyperthermia;d – hyperthermia after chemotherapy; e – hyperthermia and chemotherapy；f – chemotherapy after hyperthermia

本研究显示，42 ～ 43 ℃的高温对肺癌细胞有杀伤作用，这可能由于癌细胞加热至42 ℃左右时呼吸受抑制，而癌细胞内外因糖的分解造成乳糖蓄积，pH值下降，细胞内溶菌酶活性加强，从而杀灭癌细胞。另外，S期细胞对高热最敏感，处于S期的细胞受热后膜的损伤严重，可出现染色体畸变，形成多核细胞，分裂后死亡，导致S期细胞所占比例减少[9-10]。38 ～ 41 ℃的单纯热疗促进了肺癌细胞的生长，可能与细胞生长周期同步化有关，因为较低的温度时细胞损伤较轻，导致细胞分裂迟滞，细胞生长周期趋向于同步化，造成细胞增生，提示对于肿瘤患者，单纯的亚高温热疗（38 ～ 41℃）是不可取的[11-12]。而在临床热疗中，给患者升高温度需要一个过程，这不可避免会使患者处于一段较长的低热（38 ～ 41 ℃）期，并且肿瘤组织各部分的受热也不均匀，高温时仅一部分（中心部位）处于42 ～ 43 ℃，其余大部分肿瘤的温度处于39 ～ 42 ℃[13]。

本实验结果表明：亚高温或高温热疗与化疗同时作用以及热疗后3 h内进行化疗的结合方式均能够提高长春瑞滨的细胞毒作用，其中尤以热化疗同时进行效果最佳。分析原因可能是由于热疗使细胞膜的生物完整性受到破坏，通透性升高，致使化疗药进入细胞内的量增多，增强了细胞毒作用[14]。但随着热疗后进行化疗间隔时间的逐渐延长，因高热受损的细胞膜逐步得到修复，致使进入细胞内的长春瑞滨的量逐渐减少，间隔时间超过3 h后，细胞膜完全得到修复，温热的增敏作用也就停止了。细胞周期分析进一步发现，与单纯化疗相比，热化同时组处于G2/M期的细胞所占比例显著减少，可能是热化同时组主要使阻滞于G2/M期细胞的死亡率（和或凋亡率）增加所致，有些学者认为热化疗联合能够在基因水平和蛋白水平显著下调 CyclinD1和PCNA 的表达，推测由于细胞周期相关蛋白的改变进而引起细胞周期阻滞可能是热化疗抑制细胞增殖的机制之一[15-17]。另一方面，S期细胞对高热最敏感，而长春瑞滨主要作用于癌细胞的M期，这提示高热与长春瑞滨并用时，对肺癌细胞各期均有协同杀伤作用。

总之，本研究从细胞水平初步探讨了温热对化疗药长春瑞滨增敏的规律，所选用细胞株的增殖特点与一般肺癌细胞株相似，另外，该细胞株具有倍增时间短、分裂指数高、增殖倍数大等特点，但要进一步应用于临床实践, 还有待于从动物实验水平上进行验证。